趙龍，劉玲玲，李曉麗，周艷芳，王好，張贏予，孔彪，沈冬麗，張國輝

（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212002）

高糖條件下心臟成纖維細(xì)胞對心肌細(xì)胞肥大的影響

趙龍，劉玲玲，李曉麗，周艷芳，王好，張贏予，孔彪，沈冬麗，張國輝

（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212002）

目的：研究高糖條件下心臟成纖維細(xì)胞對心肌細(xì)胞肥大的影響。方法：將體外分離培養(yǎng)的SD乳鼠心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞隨機(jī)分為心肌細(xì)胞低糖組（A組），心肌細(xì)胞高糖組（B組），心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)高糖組（C組），心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)加轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）中和抗體高糖組（D組），心臟成纖維細(xì)胞低糖組（E組），心臟成纖維細(xì)胞高糖組（F組）。培養(yǎng)0，6，12，24，48，72 h后，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、拍照并計(jì)算心肌細(xì)胞表面積，RT-PCR檢測心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC）mRNA表達(dá)水平，ELISA檢測各組培養(yǎng)液中TGF-β1表達(dá)量。結(jié)果：培養(yǎng)48 h時(shí)，B組心肌細(xì)胞表面積比A組顯著增加（P＜0.05），而C組在培養(yǎng)24 h時(shí)心肌細(xì)胞表面積已顯著高于A組（P＜0.05）。RT-PCR顯示B組和D組細(xì)胞在培養(yǎng)12 h時(shí)，ANP、β-MHCmRNA顯著升高（P＜0.05），培養(yǎng)24 h時(shí)達(dá)高峰；而C組在培養(yǎng)6 h時(shí)ANP、β-MHCmRNA即顯著升高（P＜0.05），培養(yǎng)12 h時(shí)達(dá)高峰。ELISA檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)12 h起B(yǎng)組、D組TGF-β1的表達(dá)均顯著高于A組（P＜0.05），而在培養(yǎng)6 h時(shí)C組TGF-β1的表達(dá)即已顯著高于A組（P＜0.05）。F組各時(shí)間點(diǎn)成纖維細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)均高于E組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：心臟成纖維細(xì)胞在高糖條件下可能通過旁分泌TGF-β1促進(jìn)心肌細(xì)胞的肥大。

高糖；心臟成纖維細(xì)胞；心肌細(xì)胞；轉(zhuǎn)化生長因子β1；心肌肥大

糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）病理表現(xiàn)為心肌肥大、細(xì)胞外基質(zhì)沉積和心肌纖維化等，有關(guān)心肌細(xì)胞肥大的發(fā)病機(jī)制尚不確切，但高血糖能直接作用于心肌細(xì)胞致其肥大已被廣泛證實(shí)［1－3］。最新研究表明心臟成纖維細(xì)胞能夠介導(dǎo)心肌細(xì)胞的肥大［4］，但其機(jī)制尚未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)通過觀察高糖條件下心臟成纖維細(xì)胞對心肌細(xì)胞肥大的作用，以探討高糖條件下心臟成纖維細(xì)胞對DCM心肌細(xì)胞肥大的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與主要試劑健康的0～3日齡SD乳鼠（江蘇大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供），DMEM、胰蛋白酶、5溴脫氧尿嘧啶核苷（美國Sigma公司），標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（美國Hyclone公司），Millicell插入式培養(yǎng)皿（美國Mlilipore公司），轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）中和抗體（美國R＆D公司），倒置相差顯微鏡（日本尼康公司），Trizol（上海生工生物工程公司），大鼠TGF-β1ELISA試劑盒（上海奇康生物科技公司），RT-PCR試劑盒（TaKaRa公司），其余生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 SD乳鼠心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng) 取0～3 d健康SD乳鼠，超凈工作臺無菌條件下取出心臟，置于4℃預(yù)冷的PBS液中吹洗3次，將心臟剪成1 mm3的組織塊用0.08%的胰蛋白酶37℃水浴箱中振蕩消化8 min，吸棄前2次消化液，以后收集每次消化后的上清置于含等體積20%胎牛血清的DMEM中中和。重復(fù)上述消化過程3～5次，將收集的細(xì)胞懸液離心、重懸、過濾、接種，接種細(xì)胞加入到含10%胎牛血清的DMEM中37℃、5% CO2孵育箱中差速培養(yǎng)1.5 h，心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞得以分離并分別培養(yǎng)。心肌細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入0.1 mmol／mL的5溴脫氧尿嘧啶核苷來抑制心臟成纖維細(xì)胞的生長，得到高純度的心肌細(xì)胞，按用途以不同密度接種于6孔板中，置于37℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)待用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將體外分離的心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞隨機(jī)分為心肌細(xì)胞低糖組（A組），心肌細(xì)胞高糖組（B組），心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)高糖組（C組），心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)加TGF-β1中和抗體高糖組（D組），心臟成纖維細(xì)胞低糖組（E組），心臟成纖維細(xì)胞高糖組（F組）。低糖組葡萄糖濃度為5.6 mmol／L，高糖組葡萄糖濃度為25 mmol／L。用于形態(tài)學(xué)觀察時(shí)6孔板中每孔接種心肌細(xì)胞密度為（10～20）×104／mL，用于mRNA測定時(shí)6孔板中每孔接種心肌細(xì)胞密度為（50～60）×104／mL。

1.2.3 共培養(yǎng)體系的建立 C組和D組取第2代成纖維細(xì)胞，以心臟成纖維細(xì)胞比心肌細(xì)胞為1∶4的比例加入到共培養(yǎng)插件Millicell裝置中，預(yù)培養(yǎng)12 h后將Millicell插件插入到預(yù)先培養(yǎng)心肌細(xì)胞的6孔板中，建立心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞非直接接觸的共培養(yǎng)體系。

1.2.4 心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及心肌細(xì)胞表面積的計(jì)算 倒置相差顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及搏動情況，并于相應(yīng)處理后0，24，48，72 h拍照，拍照后每組隨機(jī)取5個(gè)視野，每個(gè)視野隨機(jī)取6個(gè)細(xì)胞，共30個(gè)細(xì)胞，使用NIS-Elements軟件（Nikon倒置相差顯微鏡自帶軟件）計(jì)算心肌細(xì)胞表面積。

1.2.5 RT-PCR檢測心房鈉尿肽（ANP）、β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）mRNA的表達(dá) 以Trizol法提取細(xì)胞總RNA，以β-肌動蛋白為內(nèi)參。引物由上海生工生物工程公司合成，ANP上游引物：5′-GGGTAGGATTGACAGGATTGG-3′，下游引物：5′-CGTGATAGATGAAGACAGGAAGC-3′，產(chǎn)物長度199 bp；β-MHC上游引物：5′-AGGAACAGGCCAACACCAAC-3′，下游引物：5′-CAAAGGCTCCAGGTCTCAGG-3′，產(chǎn)物長度209 bp；β-肌動蛋白上游引物：5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′，下游引物：5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′，產(chǎn)物長度207 bp。按試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以cDNA為模板進(jìn)行目的片段的PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃30 s，然后95℃5 s，60℃34 s，共40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物的特異性通過熔解曲線分析確認(rèn)。反應(yīng)結(jié)束后，數(shù)據(jù)以2－ΔΔCT法表達(dá)。

1.2.6 ELISA法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β1含量 各培養(yǎng)組在處理前更換為無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，分別抽取低、高糖處理0，6，12，24，48，72 h培養(yǎng)液離心后留取上清，按ELISA試劑盒操作，酶標(biāo)儀（450 nm）檢測各孔光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β1濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞表面積計(jì)算結(jié)果

剛分離接種后的心肌細(xì)胞呈圓形，培養(yǎng)4 h后細(xì)胞開始貼壁生長，逐漸由圓形變?yōu)樗笮?，偶見單個(gè)細(xì)胞開始搏動；24 h后細(xì)胞開始伸開，伸出偽足，部分變?yōu)榘魻?、三角形、多邊形及不?guī)則形態(tài)，90%以上細(xì)胞開始搏動，頻率75～150次／min，3 d后細(xì)胞偽足交織成網(wǎng)，形成細(xì)胞單層或細(xì)胞簇，其搏動呈現(xiàn)同步化。

心肌細(xì)胞貼壁48 h換液做相應(yīng)處理后，于0，24，48，72 h在倒置相差顯微鏡下拍照（圖1）。根據(jù)細(xì)胞照片統(tǒng)計(jì)心肌細(xì)胞表面積，結(jié)果顯示，24 h時(shí)B組心肌細(xì)胞表面積和A組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），C、D組心肌細(xì)胞表面積顯著高于A組，且C組顯著高于B組、D組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；48 h、72 h時(shí)B、C、D組心肌細(xì)胞表面積均顯著高于A組，且C組心肌細(xì)胞表面積均顯著高于B組、D組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

圖1 培養(yǎng)不同時(shí)間后的心肌細(xì)胞形態(tài)（倒置顯微鏡×200）

表1 各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間表面積 μm3，±s，n＝30

表1 各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間表面積 μm3，±s，n＝30

a：P＜0.05，與A組比較；b：P＜0.05，與B、D組比較

組別0 h 24 h 48 h 72 h A組 562.26±84.43 667.31±126.42 734.89±120.75 843.38±142.96 B組 569.87±121.98 717.31±134.67 1 107.90±207.41a 1 473.50±306.97a C組 544.32±155.21 1 102.72±239.44a，b 1 458.35±310.42a，b 1 804.10±400.23a，b D組 546.22±55.78 796.40±79.67a 1 137.24±151.56a 1 594.06±64.96a F值＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 1.03 46.64 57.21 62.02 P值

2.2 各組心肌細(xì)胞ANP、β-MHCmRNA的表達(dá)

RT-PCR顯示B組和D組細(xì)胞在培養(yǎng)12 h時(shí)，ANP、β-MHCmRNA顯著升高（P＜0.05），培養(yǎng)24 h時(shí)達(dá)高峰；而C組在培養(yǎng)6 h時(shí)ANP、β-MHCmRNA即顯著升高（P＜0.05），培養(yǎng)12 h時(shí)達(dá)高峰；D組培養(yǎng)24 h時(shí)ANP、β-MHC mRNA的表達(dá)較B組顯著增高（P＜0.05），且以后都高于B組，但低于C組。見圖2。

2.3 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1的表達(dá)

ELISA法檢測結(jié)果顯示，B、D組細(xì)胞在培養(yǎng)12 h以后各時(shí)間段TGF-β1的表達(dá)均高于A組相應(yīng)時(shí)間（P＜0.05），而C組在培養(yǎng)6 h時(shí)TGF-β1的表達(dá)即已顯著顯高于A組（P＜0.05），C組在培養(yǎng)12，24，48，72 h各時(shí)間點(diǎn)TGF-β1的表達(dá)均顯著高于B組、D組相應(yīng)時(shí)間（P＜0.05）（表2）。F組各時(shí)間段TGF-β1的表達(dá)都明顯高于E組相應(yīng)時(shí)間（P＜0.05）（表3）。

圖2 各組心肌細(xì)胞不同培養(yǎng)時(shí)間ANP、β-MHC mRNA的表達(dá)

表2 各組心肌細(xì)胞不同培養(yǎng)時(shí)間上清中TGF-β1的含量 pg／m L，±s，n＝3

表2 各組心肌細(xì)胞不同培養(yǎng)時(shí)間上清中TGF-β1的含量 pg／m L，±s，n＝3

a：P＜0.05，與A組比較；b：P＜0.05，與B組、D組比較

組別6 h 12 h 24 h 48 h 72 h A組 1 251.98±2.57 1 261.69±16.69 1 272.37±10.08 1293.72±13.18 1 344.40±14.81 B組 1 255.41±14.54 1 302.81±8.35a 1 530.79±25.06a 1 683.82±5.27a 1 696.69±6.37a C組 1 270.45±8.13a 1 365.42±7.96a，b 1 756.16±13.12a，b 1 827.37±27.85a，b 1 850.15±22.05a，b D組 1 267.17±6.65 1 294.25±9.30a 1 532.1±24.09a 1 704.87±6.65a 1 705.61±8.97a F值2.37 45.32 313.26 629.43 671.41 P值 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表3 心臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β1的含量 pg／m L，±s，n＝3

表3 心臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β1的含量 pg／m L，±s，n＝3

組別6 h 12 h 24 h 48 h 72 h E組 1 276.28±12.26 1 331.25±8.81 1 530.91±21.84 1 5.27 7.76 8.70 12.62 16.93 P值550.88±15.09 1 581.16±8.71 F組 1 300.88±5.76 1 468.03±32.34 1 610.43±21.63 1 680.35±5.64 1 780.41±16.17 t值＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

DCM是一種特異性心肌病，其發(fā)病不依賴于高血壓、冠心病、心臟瓣膜病、先天性心臟病和其他已知心臟疾病。其發(fā)病機(jī)制尚不確切，但根本上是由于高血糖、胰島素缺乏或胰島素抵抗與高胰島素血癥所引起的一系列級聯(lián)反應(yīng)所致，各因素間相互影響，共同促進(jìn)疾病的進(jìn)展。作為糖尿病所致心力衰竭的重要原因之一，DCM受到了廣泛的關(guān)注。

持續(xù)的高血糖被認(rèn)為是DCM的重要發(fā)病機(jī)制，心肌肥大和繼發(fā)的心力衰竭是DCM顯著的臨床表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，高糖條件下能夠誘導(dǎo)離體大鼠心肌細(xì)胞發(fā)生肥大，但其機(jī)制未明確闡述［1－3］。本實(shí)驗(yàn)在高糖條件下對心肌細(xì)胞進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)也誘導(dǎo)出了心肌肥大，與上述研究一致。除高血糖能引起心肌細(xì)胞肥大外，在成人心臟中成纖維細(xì)胞能夠調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的肥大［4－5］。心臟成纖維細(xì)胞是維持心臟正常功能的主要組成部分，對應(yīng)激和損傷具有重要作用，其與周圍的心肌細(xì)胞存在旁分泌作用以及直接的細(xì)胞—細(xì)胞相互作用。心臟成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞通過旁分泌向周圍微環(huán)境釋放蛋白質(zhì)來調(diào)節(jié)周圍的細(xì)胞，心臟成纖維細(xì)胞可能通過激素的旁分泌途徑調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的表型，心肌細(xì)胞也可能通過相同的形式調(diào)節(jié)心臟成纖維細(xì)胞的表型［2］。

研究發(fā)現(xiàn)參與成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞之間旁分泌的細(xì)胞因子有TGF-β1、FGF2、IL-6家族，以及最近發(fā)現(xiàn)的IL-33因子。TGF-β1是一種多功能的細(xì)胞間信號蛋白，調(diào)節(jié)多種靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，具有多種生物學(xué)效應(yīng)。TGF-β1在心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞都有表達(dá)，而且高糖能夠刺激心臟成纖維細(xì)胞高表達(dá)TGF-β1［6］。我們的實(shí)驗(yàn)也證明了這一結(jié)果。研究表明TGF-β1參與心肌肥大的過程［7］，其致心肌肥大作用與TGF-β1結(jié)合其受體并激活Smad通路有關(guān)［8］，該過程或許參與了人類肥厚性心肌病的發(fā)病機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)通過建立心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)模型，觀察高糖條件下心臟成纖維細(xì)胞對心肌細(xì)胞肥大的作用及可能途徑。結(jié)果表明，高糖誘導(dǎo)了體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞的肥大，高糖共培養(yǎng)條件下心臟成纖維細(xì)胞明顯促進(jìn)了心肌細(xì)胞的肥大，表現(xiàn)在肥大時(shí)間的提前和肥大程度的加劇。高糖共培養(yǎng)下應(yīng)用TGF-β1中和抗體后心肌細(xì)胞肥大程度與高糖共培養(yǎng)組相比有所抑制，但仍比高糖組心肌細(xì)胞肥大明顯。這表明TGF-β1參與了高糖條件下心臟成纖維細(xì)胞影響心肌細(xì)胞肥大的過程，但不是唯一途徑。

綜上，高糖條件下心臟成纖維細(xì)胞促進(jìn)了心肌細(xì)胞的肥大，心臟成纖維細(xì)胞旁分泌的TGF-β1可能參與了這一過程，但具體機(jī)制還不明確，有待于進(jìn)一步的研究。針對心臟成纖維細(xì)胞對心肌細(xì)胞肥大機(jī)制的研究，可能為臨床上對DCM及其他心肌病的防治提供新的治療思路和方法。

［1］ Chen S，Khan ZA，Karmazyn M，et al.Role of endothelin-1，sodium hydrogen exchanger-1 and mitogen activated protein kinase（MAPK）activation in glucose-induced cardiomyocyte hypertrophy［J］.Diabetes Metab Res Rev，2007，23（5）：356－367.

［2］ Ding F，Yu L，Wang M，et al.O-GlcNAcylation involvement in high glucose-induced cardiac hypertrophy via ERK1／2 and cyclin D2［J］.Amino Acids，2013，45（2）：339－349.

［3］ Duan Y，Zhou B，Su H，et al.miR-150 regulates high glucose-induced cardiomyocyte hypertrophy by targeting the transcriptional co-activator p300［J］.Exp Cell Res，2013，319（3）：173－184.

［4］ Takeda N，Manabe I，Uchino Y，et al.Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of themurine heart to pressure overload［J］.JClin Invest，2010，120（1）：254－265.

［5］ Kakkar R，Lee RT.Intramyocardial fibroblastmyocyte communication［J］.Circ Res，2010，106（1）：47－57.

［6］ Aneja A，TangWH，Bansilal S，et al.Diabetic cardiomyopathy：insights into pathogenesis，diagnostic challenges，and therapeutic options［J］.Am JMed，2008，121（9）：748－757.

［7］ Schultz Jel J，Witt SA，Glascock BJ，et al.TGF-β1 mediates the hypertrophic cardiomyocyte growth induced by angiotensinⅡ［J］.JClin Invest，2002，109（6）：787－796.

［8］ Leask A.TGFβ，cardiac fibroblasts，and the fibrotic response［J］.Cardiovasc Res，2007，74（2）：207－212.

Effect of cardiac fibroblasts on cardiomyocyte hypertrophy induced by high glucose

ZHAO Long，LIU Ling-ling，LI Xiao-li，ZHOU Yan-fang，WANG Hao，ZHANG Ying-yu，KONG Biao，SHEN Dong-li，ZHANGGuo-hui
（Department of Cardiology，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

Objective：To investigate the effect of cardiac fibroblast on cardiomyocyte hypertrophy induced by high glucose.M ethods：Neonatal CFs and CMs isolated from 0-to 3-day-old Sprague-Dawley rats were cultured in vitro，then random ly divided into six groups：CM low glucose group（group A），CM high glucose group（group B），CM and CF co-culture high glucose group（group C），CM-CF co-culture＋TGF-β1neutralizing antibody high glucose group（group D），CF low glucose group（group E），CF high glucose group（group F）.After cultured different times（0，6，12，24，48，72），cellularmorphologies were observed under the inverted phase contrastmicroscope，the mRNA levels of cardiomyocyte hypertrophy markers ANP、β-MHC were determinated by RT-PCR，the expression of TGF-β1evaluated by ELISA.Results：Compared with group A，cell surface area of group B cultured for 48 h increased significantly（P＜0.05），group C cultured for 24 h increased significantly（P＜0.05）respectively.RT-PCR showed that compared with group A，the expression of ANP、β-MHCmRNA of group B and D cultured for 12 h increased significantly（P＜0.05），cultured for 24 h increased atmost，group C cultured for 6 h increased significantly（P＜0.05），cultured for 12 h increased atmost respectively.ELISA showed that compared with group A，the expression of TGF-β1of group B cultured for 12 h increased significantly（P＜0.05），group C cultured for 6 h increased significantly（P＜0.05）respectively；compared with group E，6 h later group F increased sig-nificantly（P＜0.05）respectively.Conclusion：Cardiac fibroblastsmay via paracrine transforming growth factor-β1promote cardiomyocyte hypertrophy induced by high glucose.

high glucose；cardiac fibroblast；cardiomyocyte；transforming growth factor-β1；cardiomyocyte hypertrophy

R541.75

A

1671－7783（2014）03－0216－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y 130274

趙龍（1985—），男，碩士研究生；張國輝（通訊作者），博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，E-mail：13338812776＠189.cn

2014－03－10 ［編輯］ 何承志