李興天，李小戰(zhàn)，馬紅，許輝，李淑，李遇梅

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

低溫凍存對(duì)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

李興天，李小戰(zhàn)，馬紅，許輝，李淑，李遇梅

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

目的：比較人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（human adipose-derived mesenchymal stem cells，hADSCs）凍存前和復(fù)蘇后的生物學(xué)特性，為今后建立低溫干細(xì)胞庫(kù)提供實(shí)驗(yàn)支持。方法：采用0.1%Ⅰ型膠原酶消化法從腹部大網(wǎng)膜脂肪組織中分離hADSCs，體外培養(yǎng)擴(kuò)增，將處于均一穩(wěn)定生長(zhǎng)狀態(tài)的第3代hADSCs置于液氮中分別凍存1、3和6個(gè)月，復(fù)蘇后臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率，采用MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原，成脂成骨誘導(dǎo)后鑒定多向分化能力，RT-PCR檢測(cè)成脂特異性基因過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ-2（peroxisome proliferator-activated receptorγ-2，PPARγ-2）和成骨特異性基因骨鈣素（osteocalcin，OC）的表達(dá)情況。結(jié)果：隨凍存時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞存活率略有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。MTT結(jié)果顯示凍存前后細(xì)胞增殖能力均很強(qiáng)。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示凍存前后細(xì)胞均高表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166，低表達(dá)CD45和HLA-DR。凍存前后hADSCs均具有向脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞分化潛能，且RT-PCR結(jié)果顯示，PPARγ-2和骨鈣素mRNA的表達(dá)凍存前后差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：經(jīng)液氮凍存后的hADSCs具有高存活率，生物學(xué)特性保持穩(wěn)定且仍具有多向分化潛能。

人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；凍存；生物學(xué)特性；干細(xì)胞庫(kù)

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）是來(lái)源于脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞，由于取材方便、對(duì)機(jī)體損傷小且易于體外培養(yǎng)，已在再生醫(yī)學(xué)研究中受到廣泛關(guān)注。近期有研究顯示，hADSCs免疫原性低，不表達(dá)HLAⅡ類(lèi)抗原且能調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的活性［1］，可以用于移植物抗宿主反應(yīng)或自身免疫性疾病的治療。將ADSCs低溫保存，就可以在患者需要的時(shí)候進(jìn)行同種同體或同種異體細(xì)胞移植，挽救患者生命。本研究將第3代ADSCs置于液氮中分別保存1、3和6個(gè)月，初步探討低溫凍存對(duì)人ADSCs生物學(xué)特性的影響，為今后建立低溫干細(xì)胞庫(kù)提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

脂肪組織取自2013年在江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科接受手術(shù)的7例產(chǎn)婦腹部大網(wǎng)膜，產(chǎn)婦年齡17～33歲，平均26歲?；颊邔?duì)實(shí)驗(yàn)知情同意，且實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器

低糖-DMEM、高糖-DMEM（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司），Ⅰ型膠原酶（Gibco公司），噻唑藍(lán)、胰蛋白酶（Amresco公司），鼠抗人單克隆抗體CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD73-FITC、CD90-PE、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-PE及其相應(yīng)同型對(duì)照（eBioscience公司），地塞米松、抗壞血酸磷酸鹽、β-甘油磷酸鈉、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素（Sigma公司），Trizol試劑（Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR-PCR試劑盒（TaKaRa公司），酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Clinibio公司），流式細(xì)胞儀（BD公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 hADSCs的分離和培養(yǎng) 外科無(wú)菌條件下取出脂肪組織約10 mL，PBS吹打清洗3次，盡量去除脂肪表面的結(jié)締組織和血管，剪成1 mm×1 mm× 1 mm的組織塊，加入2倍體積0.1%Ⅰ型膠原酶，37℃水浴消化45 min，期間每5 min取出劇烈震蕩，加入含10%胎牛血清低糖-DMEM終止消化，1 500 r／min離心10 min，去除上層漂浮的脂肪組織，沉淀重懸，200目細(xì)胞篩過(guò)濾，再離心。加入完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100 U／mL青霉素、100 mg／mL鏈霉素的低糖DMEM）重懸、接種，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后首次換液，之后每周換液2次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，以0.25%胰酶0.02%EDTA消化傳代。

1.3.2 hADSCs的凍存和復(fù)蘇 當(dāng)處于均一穩(wěn)定生長(zhǎng)狀態(tài)的第3代hADSCs生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，用0.25%胰酶 0.02%EDTA消化液消化，離心棄上清，加入凍存液（含10%DMSO、90%胎牛血清），調(diào)整細(xì)胞終密度為1×106／mL，分裝于凍存管中。經(jīng)4℃30 min→－20℃2 h→－70℃過(guò)夜→液氮。分別于凍存1個(gè)月、3個(gè)月和6個(gè)月后取出凍存管，置于37℃恒溫水浴箱內(nèi)，并不斷搖動(dòng)以促進(jìn)融化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至離心管中，加入10倍體積的完全培養(yǎng)液離心棄上清，再重懸于完全培養(yǎng)液，待細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)，常規(guī)消化傳代。

1.3.3 細(xì)胞存活率檢測(cè) 復(fù)蘇后，取出部分細(xì)胞懸液按1∶1與0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液混勻1min，采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法，光鏡下計(jì)數(shù)被染成藍(lán)色的死細(xì)胞數(shù)和未染的活細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞存活率（%）＝（活細(xì)胞數(shù)／細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.3.4 MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 取凍存前及復(fù)蘇后的第5代hADSCs，用培養(yǎng)液制成2×104／mL細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔200μL。自第2天起，每天固定時(shí)間取1塊96孔板，于各孔內(nèi)加入5 mg／mLMTT 20μL，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h后吸去上清，每孔加入150μL二甲基亞砜，搖床振蕩10 min。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上490 nm波長(zhǎng)處讀出光密度（D）值。連測(cè)8 d，以光密度值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.5 細(xì)胞免疫表型檢測(cè) 消化收集凍存前及復(fù)蘇后的第5代hADSCs，1 000 r／min離心5 min，用PBS重懸分裝于1.5 mL的EP管中，每管100μL，細(xì)胞密度為105／mL，加入鼠抗人單克隆抗體CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD73-FITC、CD90-PE、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-PE及其同型對(duì)照IgG2a-FITC、IgG1-PE。4℃避光孵育30 min，PBS洗2次，加PBS 300μL重懸后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原。

1.3.6 成脂成骨分化鑒定 取凍存前及復(fù)蘇后的第5代hADSCs接種于6孔板中，待達(dá)到80%融合時(shí)，分別改用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、0.5 mmol／L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1μmol／L地塞米松、10μmol／L胰島素、200μmol／L吲哚美辛的高糖DMEM）和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、0.1μmol／L地塞米松、50μmol／L抗壞血酸磷酸鹽、10 mmol／Lβ-甘油磷酸鈉的高糖DMEM）誘導(dǎo)2周，每周換液2次，對(duì)照組加完全培養(yǎng)液。2周后分別用油紅O［2］和von Kossa染色［3］鑒定脂滴和鈣結(jié)節(jié)。1.3.7 RT-PCR檢測(cè)成脂特異性基因過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ-2（PPARγ-2）和成骨特異性基因骨鈣素的表達(dá) 取凍存前及復(fù)蘇后的第5代hADSCs接種于6孔板中，待達(dá)到80%融合時(shí)，分別改用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)1周，換液2次，對(duì)照組加完全培養(yǎng)液。使用Trizol法提取對(duì)照組、成脂組及成骨組的RNA作為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最后按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)PPARγ-2及骨鈣素進(jìn)行擴(kuò)增，以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，結(jié)果用2－ΔΔCt法換算。擴(kuò)增基因引物序列見(jiàn)表1。

表1 擴(kuò)增基因引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 hADSCs分離培養(yǎng)

hADSCs原代培養(yǎng)48 h后，可見(jiàn)散在貼壁細(xì)胞，于第7至第8天細(xì)胞融合至80%～90%傳代，當(dāng)傳至第3代，細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)均一，呈放射狀、河流狀的梭形細(xì)胞（圖1）。

2.2 hADSCs凍存復(fù)蘇后的存活率

圖1 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)（100×）

采用臺(tái)盼藍(lán)染色方法計(jì)數(shù)，第3代hADSCs經(jīng)凍存1個(gè)月、3個(gè)月和6個(gè)月后，平均存活率分別為（95.39±3.09）%，（89.58±5.25）%和（85.39± 4.15）%，存活率隨凍存時(shí)間的延長(zhǎng)略有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

生長(zhǎng)曲線顯示第5代hADSCs凍存前及凍存1個(gè)月、3個(gè)月和6個(gè)月的增殖情況無(wú)明顯差異，均呈“S”形，在接種第3天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第7天進(jìn)入平臺(tái)期（圖2）。

圖2 凍存復(fù)蘇前后人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.4 細(xì)胞免疫表型

凍存前及凍存1個(gè)月、3個(gè)月和6個(gè)月第5代hADSCs均高表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166，低表達(dá)CD45和HLA-DR（圖3和表2），各時(shí)間段間表達(dá)率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 凍存復(fù)蘇前后人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原分布情況 %

圖3 凍存復(fù)蘇前后人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原表達(dá)

2.5 成脂成骨分化鑒定

凍存前和復(fù)蘇后hADSCs經(jīng)2周成脂成骨誘導(dǎo)，油紅O染色可見(jiàn)成脂細(xì)胞內(nèi)有較多鮮紅色脂滴，部分小脂滴融合成較大的脂滴，von Kossa染色可見(jiàn)黑褐色礦化鈣結(jié)節(jié)聚集（圖4），而對(duì)照組均為陰性。

圖4 凍存前和復(fù)蘇后hADSCs成脂成骨分化鑒定（×200）

2.6 PPARγ-2和骨鈣素mRNA的表達(dá)

凍存前及凍存1個(gè)月、3個(gè)月和6個(gè)月第5代hADSCs經(jīng)成脂和成骨誘導(dǎo)1周后，PPARγ-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為5.55±0.48，5.45±0.40，5.15±0.18和5.58±0.37，各時(shí)間點(diǎn)間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝0.84，P＞0.05）；骨鈣素mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.27±0.13，1.38±0.11，1.25± 0.12和1.32±0.16，各時(shí)間點(diǎn)間的差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝0.57，P＞0.05）。結(jié)果表明凍存與否以及凍存時(shí)間對(duì)兩種基因的表達(dá)量無(wú)明顯影響。

3 討論

干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞。Gimble等［4］提出干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)上運(yùn)用需滿足以下幾點(diǎn)：① 來(lái)源豐富；② 對(duì)機(jī)體損傷?。虎劬哂卸嘞蚍只瘽撃?；④ 可安全有效地進(jìn)行自體或同種異體移植；⑤ 可在良好作業(yè)規(guī)范指導(dǎo)下操作。脂肪組織完全滿足再生醫(yī)學(xué)的這些要求，如1 g脂肪組織可以產(chǎn)生接近5 000個(gè)干細(xì)胞，是1 g骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞的500倍［5］。因此，ADSCs正成為比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更理想的干細(xì)胞來(lái)源。

最近有研究顯示，凍存1年的人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)特性無(wú)明顯改變［6］。將抽脂術(shù)所得脂肪長(zhǎng)期凍存于液氮，復(fù)蘇后提取的ADSCs細(xì)胞數(shù)量仍可達(dá)到新鮮組織的90%［7］。如將特定代數(shù)的ADSCs進(jìn)行低溫液氮冷凍保存，在需要時(shí)復(fù)蘇，就可以由少量細(xì)胞傳代擴(kuò)增獲得足夠的干細(xì)胞，為免疫性疾病和再生醫(yī)學(xué)治療提供良好的種子細(xì)胞。

細(xì)胞低溫凍存最大的挑戰(zhàn)是冷凍和融化復(fù)蘇對(duì)細(xì)胞膜的致死性破壞［8］。本研究中，我們使用二甲基亞砜（DMSO）保護(hù)細(xì)胞，在低溫環(huán)境下可以阻止細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。采用緩慢的凍存過(guò)程（4℃30 min→－20℃2 h→－70℃過(guò)夜→液氮），復(fù)蘇時(shí)，37℃恒溫水浴箱內(nèi)不斷搖動(dòng)令其盡快融化，這一慢凍快融的方法可以盡量減少冰晶的形成從而避免細(xì)胞膜被破壞，提高了細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)中，我們將凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后，臺(tái)盼藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)凍存6個(gè)月細(xì)胞存活率仍保持在80%以上且保持較高的增殖能力，證實(shí)慢凍快融是一種切實(shí)可行的凍存方法。

凍存前后一個(gè)重要的觀察指標(biāo)是hADSCs表面分子標(biāo)志，本實(shí)驗(yàn)凍存復(fù)蘇后hADSCs均高表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166，低表達(dá)CD45和HLA-DR，免疫表型符合MSCs的鑒定標(biāo)準(zhǔn)［9－10］。此外，在成脂成骨誘導(dǎo)條件下，凍存復(fù)蘇后hADSCs仍可表達(dá)脂肪細(xì)胞特異性基因PPARγ-2［11］和成骨細(xì)胞特異性基因骨鈣素［12］，且油紅和von Kossa染色也證實(shí)其多向分化能力保持不變。

值得思考的是，DMSO在常溫下具有毒性，因此復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)洗滌和離心以盡可能除去或減少培養(yǎng)基中DMSO的濃度，能否找到一種無(wú)毒有效的凍存劑來(lái)替代DMSO，有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探索。

本實(shí)驗(yàn)不能確定凍存超過(guò)6個(gè)月后干細(xì)胞特性有無(wú)明顯變化，但單次液氮－196℃儲(chǔ)存6個(gè)月后，hADSCs具有高存活率，生物學(xué)特性保持穩(wěn)定且仍具有多向分化潛能，為今后建立低溫干細(xì)胞庫(kù)提供了實(shí)驗(yàn)支持。

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Effect of cryopreservation on biological characteristics of human adipose-derived mesenchymal stem cells

LIXing-tian，LIXiao-zhan，MAHong，XU Hui，LIShu，LIYu-mei
（Department of Dermatology，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To provide the experimental support for establishing a low-temperature stem cell bank for future use，freeze-thawed human adipose-derived mesenchymal stem cells（hADSCs）were compared with fresh hADSCs in vitro.M ethods：The hADSCs were isolated from abdomen epiploica adipose tissue by collagenase digestion and subcultured in vitro.The third passage of hADSCswas cryopreserved in liquid nitrogen for 1，3，and 6 months.Cell viability，proliferation potential，expression of cellularmarkers and multipotential differentiation were studied after thawing using trypan blue staining，MTTmethod，flow cytometry analysis，Oil Red O staining，von Kossa，and RT-PCR.Results：After thawing，cell survival rate was found to descend as the time of cryopreservation prolonged.MTT revealed high capability for the proliferation.Phenotypic studies revealed that hADSCswere positive for CD29，CD44，CD73，CD90，CD105，CD166 and negative for CD45，and HLA-DR.Functional analysis demonstrated these cells could be differentiated into adipocytes and osteoblasts in lineage-specific medium.RT-PCR results proved that adipogenic and osteogenic related genes could be expressed.No significant difference（P＞0.05）was noted before and after the cryopreservation in cell viability，proliferation potential，expression of cellularmarkers and multipotential differentiation.Conclusions：The hADSCs could maintain acceptable viability，biological characteristics，and multipotential differentiation after cryopreservation.

human adipose-derived mesenchymal stem cells；cryopreservation；biological characteristics；stem cell bank

李興天（1987—），男，碩士研究生；李遇梅（通訊作者），副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail：drlymmg＠gmail.com

R329.2

A

1671－7783（2014）03－0190－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y140070

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30972663）

2014－03－22 ［編輯］ 陳海林