丁銀慧，孫競(jìng)，錢元霞，李蕓子，高靜，陳赟

（1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院泌尿外科，江蘇南京210008）

晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及線粒體功能紊亂

丁銀慧1，孫競(jìng)1，錢元霞1，李蕓子1，高靜1，陳赟2

（1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院泌尿外科，江蘇南京210008）

目的：觀察晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激水平和線粒體功能的影響，以探討糖尿病血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙可能的發(fā)生機(jī)制。方法：以不同質(zhì)量濃度（50，100μg／mL）的AGE修飾的牛血清白蛋白（AGE-bovine serum albumin，AGE-BSA）作用于人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（human aortic endothelial cells，HAECs）48 h，CCK-8法測(cè)定HAECs的增殖能力，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力，應(yīng)用DCFH-DA探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平；JC-1法檢測(cè)線粒體膜電位（mitochondrialmembrane potential，MMP），熒光素?zé)晒馑孛阜ê虲lark氧電極法測(cè)定細(xì)胞中ATP含量及細(xì)胞耗氧率。結(jié)果：AGE-BSA能顯著性地抑制HAECs增殖，增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平，降低SOD活力，且高質(zhì)量濃度作用更加明顯。同時(shí)，AGE-BSA還能使MMP下降、ATP生成及耗氧減少。結(jié)論：AGE-BSA誘導(dǎo)HAECs產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，其機(jī)制與其造成線粒體功能紊亂相關(guān)。

晚期糖基化終產(chǎn)物；氧化應(yīng)激；線粒體；人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞

糖尿病是威脅人類健康的主要疾病之一，其慢性并發(fā)癥可涉及全身所有組織和器官，其中血管（包括大血管和微血管）病變和神經(jīng)病變表現(xiàn)最為明顯和突出。研究顯示，糖尿病患者體內(nèi)存在的氧化應(yīng)激狀態(tài)使其發(fā)生血管病變的概率大大提高，高血糖可促使內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生增加而導(dǎo)致最后的功能障礙，而內(nèi)皮功能障礙是糖尿病血管病變發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)。近來晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）在多種糖尿病并發(fā)癥中的病理生物學(xué)作用已成為研究的熱點(diǎn)，AGEs的蓄積被認(rèn)為是糖尿病患者發(fā)生內(nèi)皮功能障礙的原因之一。研究表明，糖尿病患者血漿中AGEs蓄積水平明顯增高，且隨著病程的延長(zhǎng)AGEs濃度也逐漸增加［1］，其通過促進(jìn)ROS的生成、基底膜與胞質(zhì)交流及通過與AGEs受體（RAGE）的作用調(diào)節(jié)各種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，加快糖尿病患者微血管和大血管的損傷［2－4］。線粒體是真核細(xì)胞中重要的細(xì)胞器之一，是細(xì)胞的“能量工廠”。此外，線粒體也是內(nèi)源性ROS的主要來源，電子傳遞過程中有2%的O2和漏電子相結(jié)合，形成氧自由基，而線粒體又對(duì)氧化應(yīng)激有高敏感性，可造成線粒體DNA的不穩(wěn)定和突變，最終造成能量調(diào)節(jié)過程受損［5］。在糖尿病進(jìn)程中，線粒體產(chǎn)生了過多的ROS，使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。

本研究以人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（human aortic endothelial cells，HAECs）為研究對(duì)象，觀察AGEs對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激水平和線粒體功能的影響，探討糖尿病血管內(nèi)皮功能障礙可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

Heraeus CO2孵箱；Nikon eclipse TS100倒置式顯微鏡；Nikon Ti-E活細(xì)胞熒光工作站；SpectraMax 190酶標(biāo)儀；Spectra MaxGemini熒光酶標(biāo)儀；化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀；Oxygrtherm Clark氧電極。

AGE修飾的牛血清白蛋白（AGE-BSA）（美國(guó)Biovision公司）；F12培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；0.25%胰酶（美國(guó)Amresco公司）；CCK-8試劑及ATP檢測(cè)試劑盒、DCFH-DA活性氧檢測(cè)試劑盒（南通碧云天生物技術(shù)有限公司）；JC-1（美國(guó)Molecular Probes公司）；總超氧化物歧化酶（T-SOD）測(cè)試盒及考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒（南京建成生物工程研究所）；其余未特殊注明的試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞株及培養(yǎng)

HAECs（由南京鼓樓醫(yī)院周六化老師惠贈(zèng)）用含10%胎牛血清F12培養(yǎng)基在37℃、5%CO2及飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HAECs，消化、計(jì)數(shù)，以3×104個(gè)／mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL。培養(yǎng)24 h后加入不同質(zhì)量濃度的AGE-BSA（50，100 μg／mL），對(duì)照組加入等體積的含10%胎牛血清DMEM，作用48 h后，每孔加入10μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定光密度（D）值。

1.4 細(xì)胞中SOD活力的測(cè)定

細(xì)胞中SOD活力的測(cè)定，嚴(yán)格按照SOD測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平

各組按要求處理結(jié)束后吸去培養(yǎng)基，PBS洗1次，加入無血清培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA溶液，使其終濃度為10μmol／L，37℃孵育30 min，然后PBS洗2次，在熒光顯微鏡下觀察或使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.6 JC-1染色檢測(cè)線粒體膜電位

各組按要求處理結(jié)束后吸去培養(yǎng)基，加入5μg／mL的JC-1，37℃孵育30 min，然后PBS洗2次，在熒光顯微鏡下觀察或使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.7 熒光素?zé)晒馑孛阜z測(cè)ATP的生成

用6孔板接種HAECs，各組按要求處理結(jié)束后吸去培養(yǎng)基，用PBS洗2次，經(jīng)ATP裂解液裂解，4℃12 000×g離心10 min，取上清。取96孔化學(xué)發(fā)光專用培養(yǎng)板，每孔加入100μL ATP檢測(cè)試劑，反應(yīng)2 min，扣除本底后每孔加入相同體積的樣本，用化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，計(jì)算樣本中ATP的濃度。將樣本進(jìn)行蛋白含量測(cè)定，計(jì)算每毫克蛋白ATP的量。

1.8 Clark氧電極法檢測(cè)細(xì)胞耗氧率

用6孔板接種HAECs，各組按要求處理結(jié)束后吸去培養(yǎng)基，收集細(xì)胞于離心管中，用氧電極檢測(cè)每組細(xì)胞的耗氧率［nmol／（min·mL）］。最后對(duì)每組細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)耗氧率及細(xì)胞密度計(jì)算每組細(xì)胞的耗氧率［nmol O2／（min·104細(xì)胞）］。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 AGE-BSA對(duì)HAECs細(xì)胞增殖活性的影響

與對(duì)照組相比，50μg／mL和100μg／mL的AGE-BSA能顯著降低細(xì)胞活性（P＜0.05），且AGE-BSA高濃度組較低濃度組細(xì)胞活性也有顯著下降（P＜0.05），隨著AGE-BSA濃度增加細(xì)胞增殖活性不斷下降（圖1）。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，隨著AGE-BSA濃度的增加，AGE-BSA處理組細(xì)胞數(shù)目減少，胞體形態(tài)不如對(duì)照組飽滿，且變圓脫壁的細(xì)胞也有所增加（圖2）。

圖1 AGE-BSA對(duì)HAECs增殖活性的影響

圖2 AGE-BSA對(duì)HAECs形態(tài)的影響（200×）

2.2 AGE-BSA對(duì)HAECs中SOD活力的影響

SOD活力測(cè)定結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，AGEBSA處理組的SOD活力顯著下降（P＜0.05），且AGE-BSA高濃度組較低濃度組SOD活力也有顯著下降（P＜0.05）（圖3）。

圖3 AGE-BSA誘導(dǎo)HAECs中SOD活力下降

2.3 AGE-BSA對(duì)HAECs中ROS水平的影響

DCFH-DA熒光探針檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，AGE-BSA（50，100μg／mL）作用于HAECs時(shí)，細(xì)胞中ROS含量顯著增加（P＜0.05）（圖4）；如圖5所示，與對(duì)照組相比，AGE-BSA處理組的細(xì)胞中綠色熒光明顯較強(qiáng)，與定量結(jié)果相一致。

圖4 AGE-BSA對(duì)HAECs中ROS含量的影響

圖5 DCFH-DA染色后拍攝熒光照片（400×）

2.4 AGE-BSA對(duì)HAECs線粒體功能的影響

2.4.1 AGE-BSA對(duì)線粒體膜電位的影響 JC-1染色檢測(cè)線粒體膜電位結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，50 μg／mL和100μg／mL AGE-BSA能顯著降低細(xì)胞中線粒體膜電位（P＜0.05）（圖6）；如圖7所示，AGE-BSA組的線粒體膜電位明顯低于對(duì)照組，表明AGE-BSA作用后線粒體膜電位降低，與定量結(jié)果相一致。

圖6 AGE-BSA誘導(dǎo)HAECs中JC-1的紅／綠熒光比值下降

圖7 JC-1染色后拍攝熒光照片（200×）

2.4.2 AGE-BSA對(duì)ATP含量及耗氧率的影響 熒光素 熒光素酶法檢測(cè)ATP含量結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，AGE-BSA能顯著降低細(xì)胞ATP水平（P＜0.05），且100μg／mL AGE-BSA組較50μg／mL AGE-BSA組ATP水平有顯著下降（P＜0.05）（圖8）。測(cè)定耗氧率結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，50μg／mL和100μg／mL AGE-BSA均顯著降低細(xì)胞的耗氧率（P＜0.05），且隨著AGE-BSA質(zhì)量濃度的增高，細(xì)胞耗氧率呈不斷下降的趨勢(shì)（P＜0.05）（圖9）。

圖8 AGE-BSA誘導(dǎo)HAECs中ATP水平下降

圖9 AGE-BSA誘導(dǎo)HAECs耗氧率下降

3 討論

糖尿病血管內(nèi)皮功能障礙是糖尿病血管病變發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)，大量研究表明，AGEs與RAGE的相互作用在糖尿病血管內(nèi)皮功能障礙中發(fā)揮著重要作用。但AGEs引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的機(jī)制仍不甚完善。有文獻(xiàn)報(bào)道AGEs能引起胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，同時(shí)能降低細(xì)胞抗氧化能力［6－7］；另有文獻(xiàn)報(bào)道AGEs也能導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞中ROS的升高從而導(dǎo)致功能障礙［8－10］；本實(shí)驗(yàn)室前期研究也發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血管發(fā)生重構(gòu)，總SOD和Mn-SOD活力下降［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AGE-BSA可以引起HAECs增殖活性下降，并且使得SOD活力下降及ROS水平的升高，與既往研究結(jié)果相一致。研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激已成為糖尿病并發(fā)癥發(fā)生和發(fā)展的一個(gè)重要的致病因子［12－13］。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明通過添加抗氧化劑或過表達(dá)SOD或過氧化氫酶能夠預(yù)防組織細(xì)胞的病變，間接證明了ROS在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生中起著重要作用［14－16］。而線粒體是ROS的主要來源，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞線粒體電子傳遞鏈被中斷時(shí)，高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞ROS增加受阻［17］。Giacco等［13］研究認(rèn)為高糖誘導(dǎo)超氧化物產(chǎn)生，隨后刺激其他途徑產(chǎn)生更多超氧化物發(fā)揮更強(qiáng)的損傷作用，同時(shí)線粒體功能也不斷受損，使機(jī)體陷入氧化損傷的漩渦中，在這整個(gè)過程中線粒體都是必不可少的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AGE-BSA能夠使HAECs線粒體的膜電位及細(xì)胞耗氧能力下降，也使得ATP產(chǎn)生明顯減少，說明AGE-BSA作用能夠使線粒體功能發(fā)生紊亂。由于線粒體膜電位的降低是細(xì)胞發(fā)生凋亡的標(biāo)志事件［18］，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)，因此，推斷AGE-BSA可能通過線粒體途徑引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，具體機(jī)制還需要作進(jìn)一步研究。有文獻(xiàn)提出，氧化損傷、ATP合成缺陷和鈣離子失調(diào)往往一起發(fā)生，并且其中某一種情況的出現(xiàn)都會(huì)導(dǎo)致其他兩種情況的發(fā)生，然后形成一個(gè)惡性循環(huán)，最后通過誘導(dǎo)線粒體通透性孔道的開放，導(dǎo)致線粒體的失能［19］。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明AGE-BSA使HAECs發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致線粒體功能紊亂，最終導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。綜上所述，AGE-BSA能夠使HAECs產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，并使得HAECs線粒體功能受損，說明AGE-BSA損傷細(xì)胞過程中線粒體起著重要作用，提示通過保護(hù)線粒體對(duì)抗高血糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能是治療糖尿病血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的有效手段。

［1］ Meerwaldt R，Links T，Zeebregts C，etal.The clinical relevance of assessing advanced glycation endproducts accumulation in diabetes［J］.Cardiovasc Diabetol，2008，7：29.

［2］ Goldin A，Beckman JA，Schmidt AM，et al.Advanced glycation end products-sparking the development of diabetic vascular injury［J］.Circulation，2006，114（6）：597－605.

［3］ Huebschmann AG，Regensteiner JG，Vlassara H，etal.Diabetes and advanced glycoxidation end products［J］.Diabetes Care，2006，29（6）：1420－1432.

［4］ Morita M，Yano S，Yamaguchi T，et al.Advanced glycation end products-induced reactive oxygen species generation is partly through NF-κB activation in human aortic endothelial cells［J］.JDiabetes Complicat，2013，27（1）：11－15.

［5］ Lin MT，BealMF.Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases［J］.Nature，2006，443（7113）：787－795.

［6］ Puddu A，Storace D，Durante A，et al.Glucagon-like peptide-1 counteracts the detrimental effects of Advanced Glycation End-Products in the pancreatic beta cell line HIT-T 15［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，398（3）：462－466.

［7］ Luciano VivianiG，Puddu A，SacchiG，etal.Glycated fetal calf serum affects the viability of an insulin-secreting cell line in vitro［J］.Metabolism，2008，57（2）：163－169.

［8］ Mather KJ.The vascular endothelium in diabetes—a therapeutic target？［J］.Rev Endocr Metab Dis，2013，14（1）：87－99.

［9］ Cai H，Harrison DG.Endothelial dysfunction in cardiovascular diseases：the role of oxidant stress［J］.Circ Res，2000，87（10）：840－844.

［10］ Ishibashi Y，Matsui T，Takeuchi M，et al.Glucagonlike peptide-1（GLP-1）inhibits advanced glycation end product（AGE）-induced up-regulation of VCAM-1 mRNA levels in endothelial cells by suppressing AGE receptor（RAGE）expression［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，391（3）：1405－1408.

［11］ 唐亮，高靜，李娟，等.阿托伐他汀對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠勃起功能的影響［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2012，22（3）：218－222，226.

［12］ Sedeek M，Montezano AC，Hebert RL，et al.Oxidative stress，Nox isoforms and complications of diabetes-potential targets for novel therapies［J］.J Cardiovasc Transl Res，2012，5（4）：509－518.

［13］ Giacco F，Brownlee M.Oxidative stress and diabetic complications［J］.Circ Res，2010，107（9）：1058－1070.

［14］ Ola MS，Nawaz MI，Siddiquei MM，et al.Recent advances in understanding the biochemical and molecular mechanism of diabetic retinopathy［J］.JDiabetes Complicat，2012，26（1）：56－64.

［15］ Boudina S，Abel ED.Diabetic cardiomyopathy，causes and effects［J］.Rev Endocr Metab Dis，2010，11（1）：31－39.

［16］ Stratmann B，Tschoepe D.Heart in diabetes：notonly a macrovascular disease［J］.Diabetes Care，2011，34（Suppl2）：S138－S144.

［17］ Brownlee M.The pathobiology of diabetic complications a unifying mechanism［J］.Diabetes，2005，54（6）：1615－1625.

［18］ Bouchier-Hayes L，Lartigue L，Newmeyer DD.Mitochondria：pharmacological manipulation of cell death［J］.JClin Invest，2005，115（10）：2640－2647.

［19］ Smith RA，Hartley RC，Cocheme＇HM，etal.Mitochondrial pharmacology［J］.Trends Pharmacol Sci，2012，33（6）：341－352.

Advanced glycation end products induce oxidative stress and m itochondrial dysfunction in human aortic endothelial cells

DING Yin-hui1，SUN Jing1，QIAN Yuan-xia1，LIYun-zi1，GAO Jing1，CHEN Yun2
（1.School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.Department of Urology，Affiliated Drum Tower Hospital，School of Medicine，Nanjing University，Nanjing Jiangsu 210008，China）

Objective：To investigate whether advanced glycation end products（AGEs）can induce cell injury and mitochondrial dysfunction in human aortic endothelial cells（HAECs）.M ethods：HAECs were treated with increasing concentrations（50，100μg／mL）of AGE-bovine serum albumin（AGE-BSA）for 48 h.The proliferative inhibition of HAECswasmeasured by CCK-8 method.Contents of ATP and activity of superoxide dismutase（SOD）were determined by the luciferase assay and SOD kits.Reactive oxygen species（ROS）were determined by DCFH-DA staining.Mitochondrial membrane potential（MMP）was observed with JC-1 staining.Oxygen utilization wasmeasured polarographically with a Clark oxygen electrode.Results：Compared with control group，AGE-BSA（50，100μg／mL）significantly reduced HAECs proliferation.AGE-BSA significantly increased the levels of ROS，while decreased the activity of SOD compared to the control group.Importantly，AGE-BSA-mediated oxidative stresswas followed by a collapse ofmitochondrialmembrane potential（MMP），the inhibition of ATP generation，and the down-regulation of oxygen utilization.Conclusion：AGE-BSA induced oxidative stress in HAECs.Moreover，AGE-BSA-induced HAECs injury was related tomitochondrial dysfunction.

advanced glycation end products（AGEs）；oxidative stress；mitochondria；human aortic endothelial cells

丁銀慧（1989—），女，碩士研究生；孫競(jìng)（共同第一作者），男，博士，E-mail：sjyancheng＠aliyun.com；陳赟（通訊作者），主任醫(yī)師，博士，E-mail：chenyunnju＠hotmail.com；高靜（共同通訊作者），教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：jinggao＠ujs.edu.cn

R365.587

A

1671－7783（2014）03－0185－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y140004

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81270694）

2014－01－16 ［編輯］ 何承志