梁志海 唐國(guó)都 方春蕓 覃蒙斌

重癥急性胰腺炎(server acute pancreatitis, SAP)患者早期病情變化迅速、病死率高，雖然近年SAP的治療手段有很大進(jìn)步，但尋找早期干預(yù)疾病進(jìn)程、減少疾病重癥化仍是本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。生長(zhǎng)激素釋放肽-2(growthhormone releasing peptides，GHRP-2)是ghrelin受體激動(dòng)劑，它可以減輕肝臟炎癥、急性肺損傷[1-2]，而且外源性ghrelin對(duì)急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)的炎癥反應(yīng)有抑制作用[3]，但內(nèi)源性ghrelin與AP發(fā)病機(jī)制的關(guān)系未明確。本研究觀察GHRP-2干預(yù)急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis, ANP)大鼠后內(nèi)源性ghrelin表達(dá)的變化。

一、材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：健康雄性SD大鼠，12周齡，體質(zhì)量250～350 g，清潔級(jí)，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。按數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組、ANP組、GHRP-2組，每組30只。大鼠造模前禁食12 h，自由飲水。采用膽胰管逆行注射2%?；悄懰徕c(日本TCI公司)1 ml/kg體質(zhì)量的方法制備ANP模型。GHRP-2組在制模前30 min給予腹腔注射GHRP-2(杭州中肽公司)200 g/kg體質(zhì)量；ANP組制模前30 min注射等容積生理鹽水。對(duì)照組僅剖腹翻動(dòng)胰腺。術(shù)后3、6、12、24、48 h分批處死大鼠，每時(shí)點(diǎn)每組處死6只。采血分離血清，置-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。取胰腺組織，部分放入RNA保存液(廣州東盛公司)中置液氮保存?zhèn)溆?，部分?0%甲醛液固定。

2．胰腺組織病理學(xué)檢查及評(píng)分：固定的胰腺組織常規(guī)切片、HE染色。由病理科醫(yī)師盲法讀片，并參考Schmit標(biāo)準(zhǔn)[4]從水腫、出血、壞死、炎癥4個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行評(píng)分，每個(gè)項(xiàng)目由輕到重共分5級(jí)，分別計(jì)0～4分，4個(gè)項(xiàng)目評(píng)分之和作為總的病理評(píng)分，最高16分。

3．血清淀粉酶活性檢測(cè)：送廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

4．血清ghrelin、IL-1β水平檢測(cè)：采用ELISA法檢測(cè)。ghrelin試劑盒購(gòu)自武漢華美公司，IL-1β試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科公司，按說(shuō)明書(shū)操作。

5．胰腺組織ghrelin mRNA檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)胰腺組織ghrelin mRNA表達(dá)。ghrelin引物序列：上游5′-CAGAAAGCCCAGCAGAGAAAGG-3′，下游5′-GCCAACATCGAAGGGAGCAT-3′，產(chǎn)物153 bp；內(nèi)參β-actin引物序列：上游5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，產(chǎn)物150 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。取液氮保存的胰腺組織，先用液氮研磨粉碎組織，按總RNA小量制備試劑盒(美國(guó)Axygen公司)提供的方法提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒(美國(guó)Fermentas 公司)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。取其中一個(gè)樣本的cDNA按1∶4的稀釋比例等比稀釋，上熒光定量PCR儀擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)，60℃ 1 min。由儀器自帶軟件分析數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2均>0.99，擴(kuò)增效率為90%～110%。按上述體系以及反應(yīng)條件分別測(cè)定待測(cè)樣本的Ct值，采用公式2-△△Ct計(jì)算ghrelin mRNA的表達(dá)量。

二、結(jié)果

1．胰腺組織病理改變：對(duì)照組大鼠胰腺組織無(wú)明顯變化。ANP組在腹腔內(nèi)可見(jiàn)淡黃色腹水、鼓腸、腹腔臟器粘連、出現(xiàn)皂化斑；胰腺壞死，部分呈膠凍狀，部分有暗紅色出血樣改變。光鏡下見(jiàn)胰腺組織水腫、炎癥、出血、壞死，程度較輕者見(jiàn)胰腺腺泡、間質(zhì)水腫，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；較重者見(jiàn)胰腺凝固性壞死、腺小葉結(jié)構(gòu)消失；胰腺實(shí)質(zhì)內(nèi)、小葉間有大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)以及出血。GHRP-2組大鼠的胰腺組織病理改變與ANP組無(wú)明顯差異。ANP組、GHRP-2組大鼠的胰腺病理評(píng)分均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)，而GHRP-2組與ANP組間胰腺組織病理評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2．血清淀粉酶、ghrelin、IL-1β水平的變化：除48 h點(diǎn)外，ANP組各時(shí)點(diǎn)血淀粉酶活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05或<0.01)；除24 h點(diǎn)外，GHRP-2組各時(shí)點(diǎn)血淀粉酶活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05或<0.01)。但ANP組與GHRP-2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

ANP組6、12、48 h點(diǎn)血清ghrelin水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05或<0.01)；GHRP-2組3、12、48 h點(diǎn)血清ghrelin水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05或<0.01)，3 h點(diǎn)的ghrelin水平顯著高于ANP組(P<0.05，表1)。

ANP組3、6 h點(diǎn)血清IL-1β水平顯著高于對(duì)照組(P值均<0.05)；GHRP-2組3、6 h點(diǎn)血清IL-1β水平顯著低于ANP組(P值均<0.05)，其他時(shí)點(diǎn)兩組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

血清ghrelin水平與血清IL-β水平、胰腺組織水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分、病理總評(píng)分均呈正相關(guān)(r值分別為0.355、0.229、0.330、0.292，P<0.05或<0.01)。

3．胰腺組織ghrelin mRNA表達(dá)的變化：ANP組6、12、24 h點(diǎn)胰腺組織ghrelin mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05或<0.01，表1)；GHRP-2組24 h點(diǎn)胰腺組織ghrelin mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其他各時(shí)點(diǎn)無(wú)顯著差異；GHRP-2組與ANP組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組大鼠各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)比較

討論GHRP-2是一種人工合成的小分子多肽，是ghrelin的受體激動(dòng)劑，具有抗氧化應(yīng)激、抗炎等功能。Kato等[5]報(bào)道，GHRP-2可以提高心肌組織谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽的比值，同時(shí)改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的左心室功能。體外實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，GHRP-2對(duì)氧化修飾型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞氧化應(yīng)激也有抑制作用[6]。新近研究結(jié)果顯示，GHRP-2對(duì)脂多糖(LPS)引起的肝損傷有保護(hù)作用，作用機(jī)制可能與同時(shí)降低肝細(xì)胞TNF-α表達(dá)和提高IGF-1 mRNA表達(dá)有關(guān)[1]。在LPS注射引起的肺損傷研究中，GHRP-2預(yù)處理可以減少LPS引起的炎癥介質(zhì)釋放、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，從而改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的氧合能力[2]。因此，GHRP-2有可能通過(guò)抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)的途徑對(duì)疾病發(fā)展有保護(hù)作用。

Ghrelin在炎癥反應(yīng)中的保護(hù)作用已經(jīng)在多項(xiàng)研究中得到證實(shí)。在AP、急性腎損傷實(shí)驗(yàn)研究中，外源性ghrelin干預(yù)可以使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的炎癥反應(yīng)減輕[3, 7-9]，還可以抑制膿毒癥引起的炎癥反應(yīng)和多器官功能障礙[10]，其機(jī)制可能與NF-κB、促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)等信號(hào)通路有關(guān)[7,9,11]。

本研究結(jié)果顯示，血清IL-1β水平在制模后3 h達(dá)峰值，然后逐漸到正常水平，提示ANP大鼠早期炎癥反應(yīng)最明顯。制模后，ANP組、GHRP-2組大鼠血清ghrelin逐漸升高，在12 h達(dá)峰值，且血清ghrelin水平與血清IL-1β水平、胰腺組織的病理?yè)p傷呈正相關(guān)，與Dembinski等[12]采用雨蛙肽誘導(dǎo)的AP動(dòng)物模型結(jié)果類似，可作為預(yù)測(cè)AP嚴(yán)重程度的指標(biāo)。此外，ANP組大鼠胰腺組織ghrelin mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組，提示胰腺組織ghrelin mRNA表達(dá)上調(diào)也是ANP發(fā)病的早期事件。制模前應(yīng)用GHRP-2干預(yù)ANP大鼠，結(jié)果顯示GHRP-2組大鼠血清IL-1β水平較ANP組下降，血清ghrelin水平僅在制模后3 h高于ANP組，其他各時(shí)點(diǎn)均無(wú)顯著差異；而且胰腺組織病理評(píng)分、胰腺組織ghrelin mRNA表達(dá)均與ANP組無(wú)顯著差異，表明GHRP-2干預(yù)雖然在AP發(fā)病早期發(fā)揮一定的抗炎作用，同時(shí)引起血ghrelin水平升高，但對(duì)ANP胰腺的ghrelin mRNA表達(dá)無(wú)影響，也不足以改善ANP胰腺的病理?yè)p傷。這可能與ghrelin在胰腺外分泌腺泡細(xì)胞的表達(dá)量不高有關(guān)[13]。因此，GHRP-2干預(yù)ANP大鼠是否具有應(yīng)用前景尚待探討。

參 考 文 獻(xiàn)

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