許春芳 許樂樂

吉西他濱是一種新型嘧啶類抗代謝藥，主要作用于DNA合成期和晚G1期，并可阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，是近30年來美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)的第一個(gè)用于晚期胰腺癌治療的新藥。盡管吉西他濱單藥方案已經(jīng)成為胰腺癌輔助治療的標(biāo)準(zhǔn)方案，但其療效仍不能令臨床醫(yī)師滿意，且存在的不良反應(yīng)也是阻止其更廣泛應(yīng)用的主要原因，因此開發(fā)高效低毒的抗癌新藥和采用聯(lián)合化療方案仍是臨床努力的方向。本課題組前期研究[1]已證實(shí)淺藍(lán)菌素可以有效抑制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為提高對(duì)化療藥物的敏感性，本研究進(jìn)一步觀察淺藍(lán)菌素聯(lián)合吉西他濱是否對(duì)胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制具有協(xié)同作用，并探討其可能的機(jī)制。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

BxPC3細(xì)胞株由第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院饋贈(zèng)。淺藍(lán)菌素購(gòu)于美國(guó) Sigma 公司(批號(hào) C2389)，-20℃保存，用<0.1%二甲基亞砜(DMSO)稀釋成50 mg/ml原液，再用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液稀釋成所需要的濃度。吉西他濱購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，實(shí)驗(yàn)前用滅菌水稀釋成所需要的濃度。CCK-8購(gòu)自日本同仁公司。AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自Molecular Probes公司。Trizol購(gòu)自Invitrogen公司。PCR所用試劑均購(gòu)自TaKaRa公司。兔抗人Bcl-2、Bax抗體購(gòu)自EPITMICE公司。鼠抗人β-actin單抗及羊抗兔和羊抗鼠二抗、細(xì)胞周期與凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1．CCK-8法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BxPC3細(xì)胞，混懸于含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/ml。取100 μl加入96孔板培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基，分別加入含10 μg/ml淺藍(lán)菌素、20 μmol/L吉西他濱、10 μg/ml淺藍(lán)菌素+20 μmol/L吉西他濱(聯(lián)合)的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24、48、72 h，以加不含藥物培養(yǎng)液的細(xì)胞作為對(duì)照組。然后每孔加入CCK-8溶液10 μl，37℃孵育4 h。上酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)每孔450 nm波長(zhǎng)的吸光度值(A450值)，以單純培養(yǎng)液的空白孔調(diào)零，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(IR)。IR=[1-(A450值對(duì)照組-A450值處理組)/A450值對(duì)照組]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2．AnnexinV/PI雙染法：BxPC3細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，棄培養(yǎng)液，分別加入上述3種含藥物的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，2 000 r/min離心5 min，PBS 洗滌2次，加入500 μl Binding Buffer、5 μl AnnexinV(FITC)，混勻后加入5 μl PI，混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min，上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3. RT-PCR法：將BxPC3細(xì)胞以1×105/ml 的密度接種于培養(yǎng)瓶，分別加入上述3種含藥物的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)液，收集細(xì)胞。采用Trizol提取細(xì)胞總RNA。采用RT-PCR法檢測(cè)Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)。Bax引物上游5′-GCGTCCACCAAGAAGCTGA-3′，下游5′-ACCACCCTGGTCTTGGATCC-3′，產(chǎn)物312 bp；Bcl-2引物上游5′-CAGCTGCACCTGACGCCCTT-3′，下游5′-GCCTCCGTTATCCTGGATCC-3′，產(chǎn)物231 bp；內(nèi)參β-actin引物上游5′-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3′，下游5′-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3′，產(chǎn)物308 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。先逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再行PCR擴(kuò)增。PCR參數(shù)：95℃ 5 min，95℃ 30 s、59℃ 30 s、72℃ 38 s，30 個(gè)循環(huán)，最后72℃ 8 min，4℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外成像系統(tǒng)觀察，拍照，掃描。以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示mRNA相對(duì)表達(dá)量。

4．蛋白質(zhì)印跡法：收集各組培養(yǎng)細(xì)胞，提取總蛋白。測(cè)定蛋白濃度，取20 μg常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)。通過凝膠成像系統(tǒng)測(cè)定各條帶的灰度值，以目的條帶與β-actin的灰度值比表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、各組BxPC3細(xì)胞增殖能力的變化

淺藍(lán)菌素組、吉西他濱組、聯(lián)合處理組BxPC3細(xì)胞的增殖抑制率均呈時(shí)間依賴性增加，且淺藍(lán)菌素聯(lián)合吉西他濱處理組具有明顯的協(xié)同效應(yīng)(表1)。

二、各組BxPC3細(xì)胞凋亡的變化

對(duì)照組、淺藍(lán)菌素組、吉西他濱組、聯(lián)合處理組BxPC3細(xì)胞的早期凋亡率分別為(0.83±0.31)%、(31.37±1.04)%、(38.33±0.75)%、(69.43±0.83)%，各處理組均較對(duì)照組顯著增加，聯(lián)合處理組又較單藥處理組顯著增加，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3907.936，P<0.001，圖1)。

表1 淺藍(lán)菌素、吉西他濱及聯(lián)合用藥對(duì)BxPC3細(xì)胞增殖能力的影響(%，x±s)

橫坐標(biāo)表示AnnexinFITC，縱坐標(biāo)表示PI。左上象限：允許出現(xiàn)的檢測(cè)誤差；右上象限：死亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞；左下象限：正常細(xì)胞；右下象限：早期凋亡細(xì)胞

圖1對(duì)照組(a)、淺藍(lán)菌素組(b)、吉西他濱組(c)、聯(lián)合處理組(d) BxPC3細(xì)胞凋亡圖

三、各組BxPC3細(xì)胞Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的變化

對(duì)照組、淺藍(lán)菌素組、吉西他濱組、聯(lián)合處理組BxPC3細(xì)胞的Bcl-2 mRNA表達(dá)量分別為0.67±0.01、0.44±0.01、0.36±0.08、0.27±0.07；Bax mRNA為0.14±0.01、0.31±0.02、0.32±0.03、0.91±0.06；Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比值為4.78±0.13、1.39±0.04、1.15±0.02、0.30±0.02。各處理組細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)較對(duì)照組下降，而Bax mRNA的表達(dá)較對(duì)照組升高，Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比值較對(duì)照組下降，聯(lián)合治療組又較單藥處理組的變化更顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為4693.227、2770.298、1853.294，P值均為0.000，圖2)。

四、各組BxPC3細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的變化

對(duì)照組、淺藍(lán)菌素組、吉西他濱組、聯(lián)合處理組BxPC-3細(xì)胞的Bcl-2蛋白表達(dá)量分別為1.24±0.04、0.51±0.02、0.42±0.02、0.13±0.01；Bax蛋白表達(dá)量為0.20±0.05、0.47±0.01、0.54±0.01、1.21±0.03；Bcl-2/Bax比值為6.00±0.11、1.11±0.01、0.77±0.03、0.10±0.06。各處理組細(xì)胞Bcl-2表達(dá)均較對(duì)照組下降，而Bax表達(dá)較對(duì)照組升高，Bcl-2/Bax比值較對(duì)照組下降，聯(lián)合處理組又較單藥處理組的變化更顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為3530.252、2914.844、12133.729，P值均為0.000，圖3)。

圖2 對(duì)照組(1)、淺藍(lán)菌素組(2)、吉西他濱組(3)、聯(lián)合處理組(4)細(xì)胞Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá)

圖3 對(duì)照組(1)、淺藍(lán)菌素組(2)、吉西他濱(3)、聯(lián)合處理組(4)BxPC3細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)

討 論

胰腺癌是人類消化系統(tǒng)中惡性程度最高的腫瘤之一，5年生存率僅1%～4%，近年來在我國(guó)的發(fā)病率逐年上升。由于胰腺癌生長(zhǎng)快速，早期診斷困難，因此70%～80%的患者確診時(shí)已屬晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，只能通過化療和其他非手術(shù)治療來緩解癥狀和延長(zhǎng)生存期。目前使用的多數(shù)化療藥物效果不佳，中位生存期一般小于6個(gè)月[2]，同時(shí)不良反應(yīng)較大。

吉西他濱是目前胰腺癌輔助治療中最為常用的化療藥之一，它是細(xì)胞周期特異性抗代謝類藥物，是一種嘧啶類似物，主要作用于晚G1期和S期的腫瘤細(xì)胞，可阻止癌細(xì)胞由G1期向S期的發(fā)展。它在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過核苷激酶的作用轉(zhuǎn)化成活性代謝物吉西他濱二磷酸酯或三磷酸酯，競(jìng)爭(zhēng)性抑制DNA鏈的延長(zhǎng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。它還可以通過抑制DNA連接而抑制腫瘤的生長(zhǎng)，并掩蓋肽鏈的末端阻斷DNA修復(fù)。此外，它還能增強(qiáng)自我抗細(xì)胞毒素的能力，在改善晚期胰腺癌相關(guān)癥狀方面表現(xiàn)出顯著的療效。10年前的一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照研究比較了吉西他濱或5-氟尿嘧啶治療晚期胰腺癌患者的療效[3]，其中位生存期分別為5.7個(gè)月和4.2個(gè)月(P=0.00255)?；诖搜芯拷Y(jié)果，吉西他濱被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為晚期胰腺癌的一線化療藥物，為胰腺癌的治療帶來了新的希望。然而，吉西他濱對(duì)提高療效、 改善患者生活質(zhì)量有一定優(yōu)勢(shì)，但是患者生存期的延長(zhǎng)及總生存率的升高并不顯著[4]，1年生存率為 18%，總生存時(shí)間為 10個(gè)月，中位生存時(shí)間約 6個(gè)月。由此可見，盡管吉西他濱單藥是胰腺癌輔助化療的標(biāo)準(zhǔn)方案，但其療效仍不能讓臨床醫(yī)師滿意。許多研究表明，聯(lián)合化療不但能夠提高抗腫瘤的效果，而且能減少抗腫瘤藥物的使用劑量，從而降低藥物的不良反應(yīng)，提高患者化療耐受性。鑒于吉西他濱主要通過滲入DNA鏈誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此理論上可與其他能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的抗腫瘤藥產(chǎn)生協(xié)同作用。在眾多驗(yàn)證吉西他濱為基礎(chǔ)的聯(lián)合方案療效的Ⅲ期隨機(jī)對(duì)照臨床研究中，僅厄洛替尼聯(lián)合吉西他濱、貝伐單抗聯(lián)合厄洛替尼和吉西他濱2個(gè)方案可使患者得到有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的生存獲益，然而其中位生存期僅延長(zhǎng)了0.33個(gè)月[5]及1.1個(gè)月[6]。因此，在晚期胰腺癌治療方面探索新的聯(lián)合治療模式以提高療效一直是研究的熱點(diǎn)。

淺藍(lán)菌素是藍(lán)色頭孢霉的自然代謝產(chǎn)物，能夠有效地抑制脂肪酸合酶的合成，抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抗瘤機(jī)制廣泛而復(fù)雜。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)淺藍(lán)菌素在乳腺癌細(xì)胞株(包括雌激素依賴的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、ZR-75-1，非雌激素依賴的乳腺癌細(xì)胞株SKBR3、MDA435)及小鼠移植瘤模型實(shí)驗(yàn)中抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7-8]。Lawrence等[9]用淺藍(lán)菌素作用于膀胱癌細(xì)胞株T2，發(fā)現(xiàn)淺藍(lán)菌素對(duì)其具有明顯的抑制作用。同樣，Okawa等[10]研究發(fā)現(xiàn)淺藍(lán)菌素具有抗多發(fā)性骨髓瘤的作用。盡管淺藍(lán)菌素抗腫瘤的作用可能因腫瘤類型和細(xì)胞株的不同而有所差異，但根據(jù)本課題組前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見淺藍(lán)菌素對(duì)胰腺癌細(xì)胞株BxPC3的增殖生長(zhǎng)有很強(qiáng)的抑制作用，并且能誘導(dǎo)BxPC3細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞于S期，并阻止細(xì)胞由S期進(jìn)入G2期[11]，而吉西他濱主要阻止癌細(xì)胞由G1期向S期的發(fā)展，抑制DNA合成。因此設(shè)想淺藍(lán)菌素與吉西他濱聯(lián)合用藥對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株BxPC3可能具有協(xié)同作用。

根據(jù)本課題前期實(shí)驗(yàn)計(jì)算出淺藍(lán)菌素IC50為10 μg/ml，本研究選擇淺藍(lán)菌素為10 μg/ml與吉西他濱20 μmol/L聯(lián)合處理BxPC3細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，單藥處理組和聯(lián)合用藥組腫瘤細(xì)胞的增殖活性均得到有效抑制，但聯(lián)合組表現(xiàn)出更加顯著的協(xié)同抑制效應(yīng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果還顯示淺藍(lán)菌素與吉西他濱均能促進(jìn)BxPC3細(xì)胞的早期凋亡，但聯(lián)合組具有更明顯的促早期凋亡作用，且晚期凋亡率也明顯增加。

Bax、Bcl-2是線粒體途徑上游的凋亡調(diào)控基因，在細(xì)胞的凋亡中起著非常重要的作用。其中，Bcl-2是細(xì)胞凋亡抑制基因，Bax是細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因，Bax/Bcl-2的比值影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生，是腫瘤發(fā)生的決定因素[12-13]。本研究結(jié)果顯示，淺藍(lán)菌素、吉西他濱處理胰腺癌BxPC3細(xì)胞48 h后，Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)減少，Bax mRNA及蛋白表達(dá)增加，聯(lián)合作用組的效應(yīng)更明顯。由此可見淺藍(lán)菌素與吉西他濱具有協(xié)同效應(yīng)，其作用機(jī)制可能是二者聯(lián)合后使Bcl-2基因表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)，Bax基因表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，從而使抑制胰腺癌BxPC3細(xì)胞增殖的作用明顯增強(qiáng)，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

參 考 文 獻(xiàn)

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