吳漢青 王博 薛寅凱 鄭海 陳立波 吳河水

吉西他濱是臨床上抗胰腺癌的一線化療藥物。吉西他濱與生物靶向藥物聯(lián)用以提高療效和降低毒性反應(yīng)是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。Toll樣受體9(Toll-like receptor，TLR9)于2000年被首次成功克隆，配體為非甲基化胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸序列的DNA(CpG DNA)[1]。目前發(fā)現(xiàn)TLR9不僅表達(dá)于免疫細(xì)胞，還表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞，并且TLR9信號(hào)的活化與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移以及耐藥性等密切相關(guān)[2]。本研究應(yīng)用TLR9激動(dòng)劑CpG ODN2216干預(yù)胰腺癌PANCl細(xì)胞株，觀察其對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖及對(duì)吉西他濱敏感性的影響，探討提高胰腺癌化療效果的可能途徑。

材料與方法

一、材料

人胰腺癌細(xì)胞PANC1由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院普外實(shí)驗(yàn)室提供，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。CpG ODN2216序列為5′-GGGGGACGATCG-TCGGGGGG-3′，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，全硫代磷酸化修飾，PAGE純化。兔抗人TLR9單抗購(gòu)自美國(guó)cell signaling公司。免疫熒光試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)及二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)sigma公司。注射用鹽酸吉西他濱購(gòu)自法國(guó)Lilly公司。

二、免疫熒光化學(xué)法

用胰酶消化PANC1細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，滴到玻片上，常規(guī)培養(yǎng)24～36 h。取出爬片，PBS漂洗3次，每次5 min；用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS再漂洗3次；用0.5%Triton穿孔20 min，再用PBS漂洗3次后用5%BSA封閉30 min。甩干液體后，加入稀釋的TLR9單抗，用PBS代替一抗作為對(duì)照。4℃孵育過(guò)夜后PBS漂洗3次，加入稀釋的二抗置37℃孵育1 h，PBS漂洗3次后加入稀釋的SABC-FITC，置37℃繼續(xù)孵育30 min。用PBS漂洗3次，水溶性封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

三、蛋白質(zhì)印跡法

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次。加入5倍體積的組織蛋白裂解液，置冰上30 min，12 000 r/min離心2 min。上清經(jīng)蛋白定量后取50 μg常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)TLR9蛋白，以β-actin為內(nèi)參，最后ECL化學(xué)發(fā)光，暗室中曝光和顯影。采用自動(dòng)電泳凝膠成像分析軟件(Band scan v5.0)進(jìn)行圖像掃描，以TLR9蛋白與內(nèi)參灰度值比表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

四、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PANC1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml，取100 μl接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1×104個(gè)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為4組：(1)CpG ODN2216組：細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為10 μg/ml的CpG ODN2216[3]；(2)吉西他濱組：細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入含0、0.01、0.1、1、10 mg/L的吉西他濱；(3)CpG ODN2216+吉西他濱組：細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為10 μg/ml的CpG ODN2216以及分別含0、0.01、0.1、1、10 mg/L的吉西他濱；(4)對(duì)照組：培養(yǎng)液為單純的DMEM高糖培養(yǎng)液。每組細(xì)胞每個(gè)濃度吉西他濱均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。37℃培養(yǎng)72 h，分別加入MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，加入DMSO 100 μl，室溫振蕩10 min。酶標(biāo)儀測(cè)定各孔490 nm處的吸光度(A490)值，取各復(fù)孔平均值為各組結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率表示，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A490值/對(duì)照組A490值)×100%。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取均值。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、PANC1細(xì)胞的TLR9蛋白表達(dá)

免疫熒光染色結(jié)果顯示，TLR9在PANC1細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，主要表達(dá)在胞質(zhì)，呈現(xiàn)綠色熒光(圖1a)，以PBS替代TLR9一抗的對(duì)照組未見(jiàn)綠色熒光(圖1b)。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，PANC1細(xì)胞TLR9蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.834±0.056，不加抗體的對(duì)照組未檢出TLR9蛋白(圖2)。

圖1 PANC1細(xì)胞的TLR9表達(dá)(免疫熒光染色 ×200)

圖2 PANC1細(xì)胞TLR9蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)

二、PANC1細(xì)胞對(duì)吉西他濱敏感性的變化

0.01、0.1、1、10 mg/L吉西他濱干預(yù)經(jīng)CpG ODN2216處理的PANC1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為(34.1±1.3)%、(43.5±2.7)%、(76.3±2.5)%、(95.3±2.2)%，干預(yù)未經(jīng)CpG ODN2216處理的PANC1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為(14.5±0.9)%、(23.5±1.1)%、(44.8±1.4)%、(63.6±1.8)%，兩組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為21.7、12.2、19.4、18.6，P值均<0.01)。CpG ODN2216+吉西他濱組PANC1細(xì)胞對(duì)吉西他濱的半數(shù)抑制劑量(IC50)為(0.28±0.13)mg/L，吉西他濱組PANC1的IC50為(1.23±0.14)mg/L，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.6，P<0.01)。單獨(dú)應(yīng)用CpG ODN2216亦抑制PANC1細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制率達(dá)(17.4±0.8)%，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=22.4，P<0.01)。

討 論

胰腺癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，其惡性程度高，發(fā)病隱匿，對(duì)現(xiàn)有治療手段療效不佳，預(yù)后極差[4]。吉西他濱可以顯著延長(zhǎng)胰腺癌患者生存期和提高臨床受益率，它與生物靶向藥物聯(lián)用以提高療效和降低毒性反應(yīng)是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

近來(lái)發(fā)現(xiàn)Toll樣受體可能參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。而TLR9為該家族重要成員[5]。諸多的研究結(jié)果表明，TLR9誘導(dǎo)的信號(hào)通路可能在腫瘤形成過(guò)程中起著重要作用。研究還發(fā)現(xiàn)，TLR9在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)可作為腫瘤化療、免疫治療的新靶點(diǎn)[6-7]。CpG ODN為人工合成的TLR9特異性配體，以非甲基化的CpG基序?yàn)楹诵牡腄NA序列，在細(xì)菌感染過(guò)程中，機(jī)體細(xì)胞Toll樣受體9能識(shí)別細(xì)菌CpG DNA，觸發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)細(xì)菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答，提高宿主細(xì)胞清除細(xì)菌的能力。CpG DNA通過(guò)胞吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞，在溶酶體中與TLR9相互作用，并通過(guò)髓性分化因子88(MyD88)依賴的信號(hào)通路激活免疫應(yīng)答[8-9]。因此CpG ODN逐漸成為腫瘤免疫治療的候選制劑并得到青睞。

化療在胰腺癌的綜合治療中占有重要地位，其中吉西他濱可顯著提高胰腺癌患者腫瘤切除術(shù)后的生存期[10-11]。它主要通過(guò)摻入DNA鏈誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可與其他能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的抗腫瘤治療產(chǎn)生協(xié)同作用。研究顯示，通過(guò)協(xié)同活化TLR9受體，可增加癌細(xì)胞的凋亡，從而增強(qiáng)對(duì)吉西他濱的敏感性。本研究結(jié)果顯示， PANC1細(xì)胞高表達(dá)TLR9蛋白。應(yīng)用TLR9激動(dòng)劑CpG ODN2216處理PANC1細(xì)胞，可顯著提高細(xì)胞對(duì)吉西他濱的化療敏感性，細(xì)胞的生存率呈濃度依賴性下降。本研究結(jié)果為今后進(jìn)一步研究人胰腺癌細(xì)胞株的體內(nèi)化療敏感機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)

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