王 婷，趙琳蕾，張 煦，何君芳

(1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理研究所；2.甘肅省康復(fù)中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，蘭州 73000)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma,EC)是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，生育年齡至絕經(jīng)后均可發(fā)生，發(fā)病高峰在50～69歲，近年來(lái)其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[1]。富含半胱氨酸(secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)是結(jié)合于細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的生物活性糖蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、增殖和基質(zhì)合成。上皮型鈣黏素(epithelial cadherin or E-cadherin)是一種鈣依賴(lài)性細(xì)胞黏附分子，參與鈣依賴(lài)性細(xì)胞黏附機(jī)制，它介導(dǎo)嗜同種性的細(xì)胞黏附。轉(zhuǎn)錄抑制因子增強(qiáng)子(enhancer of zeste homolog 2， EZH2)是果蠅zeste基因增強(qiáng)子的人類(lèi)同源物，參與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)，與惡性腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。我們用免疫組化Envision二步法檢測(cè)SPARC、E-cadherin、EZH2在正常子宮內(nèi)膜、單純型增生、復(fù)雜型增生、不典型增生、子宮內(nèi)膜癌組織的表達(dá)，并進(jìn)一步分析SPARC、E-cadherin、EZH2表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 選取甘肅省康復(fù)中心醫(yī)院2009年1月至2013年1月手術(shù)切除子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本225例，分為以下五組：A組：正常子宮內(nèi)膜40例；B組：?jiǎn)渭冃驮錾?0例；C組：復(fù)雜型增生40例；D組：不典型增生40例；E組：不同病理分期子宮內(nèi)膜癌(均為子宮內(nèi)膜樣腺癌)組織65例。按照FIGO(2000)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)E組進(jìn)行手術(shù)-病理學(xué)分期和組織病理學(xué)分級(jí)。按腫瘤惡性程度、預(yù)后分為四組：① 組織病理學(xué)分級(jí)：G1+G2 30例，G3 35例(因 G1 和 G2 例數(shù)相對(duì) G3 較少，故取 G1 和 G2 例數(shù)的和與 G3比較)；② 手術(shù)-病理分期：I期+ II期42例，III 期+IV期23例(因 II 期、III 期和 IV 期例數(shù)相對(duì) I 期較少，故取 I～I(xiàn)I 期總病例數(shù)與 III～I(xiàn)V 期相比較)；③ 肌層浸潤(rùn)深度≤1/2有37例，>1/2有28例；④ 有淋巴轉(zhuǎn)移者24例，無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移者41例?；颊吣挲g28～75歲，平均(51.09±6.88)歲。所有患者未合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤，術(shù)前均未進(jìn)行激素治療、放療、化療?；颊吲R床、病理資料完整。

1.2 研究方法 兔抗人SPARC多肽合成抗體(bs-1133R，工作濃度1∶100)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，兔抗人E-cadherin多克隆抗體、EZH2多克隆抗體、過(guò)氧化酶標(biāo)記的鏈霉親和素(streptevidin/peroxidase)染色試劑盒、聯(lián)苯二胺(DAB)染色劑購(gòu)自北京中杉金橋生物制品有限公司。所有石蠟包埋組織均4 μm連續(xù)切片、脫蠟、水化，并以微波法進(jìn)行抗原修復(fù)，按照Sp(Envision二步法)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。蘇木素復(fù)染,脫水,透明,封片,顯微鏡觀察。

1.3 染色結(jié)果判斷 SPARC染色定位于胞漿，E-cadherin定位于細(xì)胞膜，EZH2定位于細(xì)胞核，以出現(xiàn)棕黃色顆粒且染色強(qiáng)度高于背景非特異性著色者為陽(yáng)性。染色陽(yáng)性的判斷標(biāo)準(zhǔn)：① 染色強(qiáng)度：0 分為無(wú)色；1 分為黃色；2 分為棕黃色；3 分為棕褐色；② 陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比：1分為陽(yáng)性細(xì)胞≤10%；2分：11%～50%；3分：51%～75%；4分：≥76%。染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比的乘積大于3為免疫反應(yīng)陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有計(jì)數(shù)資料的比較均采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同子宮內(nèi)膜組織中SPARC、E-cadherin、EZH2陽(yáng)性表達(dá) SPARC基因在五組之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=48.41，P<0.01)。SPARC陽(yáng)性表達(dá)在正常子宮內(nèi)膜較高，較其他四組有顯著性差異(χ2=7.44，χ2=14.05，χ2=17.07，χ2=43.16，P均<0.01)。E-cadherin蛋白在五組之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=37.37，P<0.01)。E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)在正常子宮內(nèi)膜較高，較其他四組有顯著性差異(χ2=6.67，χ2=10.31，χ2=11.67，χ2=35.43，P均<0.01)。EZH2在五組之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=29.02，P<0.01)。EZH2陽(yáng)性表達(dá)在E組較高，較其他四組有顯著性差異(χ2=21.61，χ2=17.39，χ2=11.92，χ2=7.44，P均<0.01)。詳見(jiàn)表1。

表1 不同子宮內(nèi)膜組織中SPARC、E-cadherin、EZH2陽(yáng)性表達(dá) [n(%)]

2.2 SPARC、E-cadherin、EZH2表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌病理特征的關(guān)系 SPARC的低表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌組織病理學(xué)分級(jí)、手術(shù)-病理分期、肌層浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。E-cadherin的低表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌組織病理學(xué)分級(jí)、手術(shù)-病理分期、肌層浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。EZH2的高表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌組織病理學(xué)分級(jí)、手術(shù)-病理分期、肌層浸潤(rùn)深度有關(guān)(P<0.05)，與有無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P>0.05)。

表2 SPARC、E-cadherin、EZH2的陽(yáng)性表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌病理特征的關(guān)系

2.3 子宮內(nèi)膜癌組織中SPARC、E-cadherin、EZH2表達(dá)的相關(guān)性分析 在65例子宮內(nèi)膜癌組織中SPARC陽(yáng)性表達(dá)19例, 其中16例E-cadherin表達(dá)陽(yáng)性, 一致性為84.21%;SPARC陰性46例中 E-cadherin 陰性44例, 一致性為95.65%,經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析 提示SPARC和E-cadherin 蛋白在子宮內(nèi)膜癌的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.226，P<0.05)。而SPARC陽(yáng)性表達(dá)19例, 其中5例EZH2 表達(dá)陽(yáng)性, 一致性為26.32%;SPARC陰性46例中EZH2陰性為3例, 一致性為6.52%, 經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析,提示SPARC和EZH2在子宮內(nèi)膜癌的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.201，P<0.05)；E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)18例, 其中4例EZH2表達(dá)陽(yáng)性, 一致性為22.22%;E-cadherin陰性47例中EZH2陰性為3例, 一致性為6.38%, 經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析,提示SPARC和EZH2在子宮內(nèi)膜癌的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.214，P<0.05)。

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤之一, 其發(fā)生是多基因作用、多因素參與和多階段發(fā)展的病理過(guò)程, 涉及多種癌基因和抑癌基因的異常。有關(guān)子宮內(nèi)膜癌相關(guān)基因,已有不少研究報(bào)道。SPARC又稱(chēng)作骨連接蛋白(osteonectin)、基膜-40 (BM-40)、43 kD蛋白，最初是作為人骨和牛骨主要非膠原成分于1981年被純化的[2]。SPARC是結(jié)合于細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的生物活性糖蛋白, 主要作用為調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、增殖和基質(zhì)合成。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn), 在正常人的甾體細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞中,SPARC呈限制性中度表達(dá), 在很多惡性腫瘤被SPARC表達(dá)上調(diào),如乳腺癌[3]、胃癌[4]、膀胱癌[5]、食管癌[6]、非小細(xì)胞肺癌[7]等；也有些腫瘤組織呈低水平表達(dá)或不表達(dá)，如卵巢癌[8]、胰腺癌[9]。本研究結(jié)果顯示SPARC在子宮內(nèi)膜癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于正常子宮內(nèi)膜、單純型增生、復(fù)雜型增生、不典型增生子宮內(nèi)膜組織(P<0.05)，且其低表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌組織病理學(xué)分級(jí)、手術(shù)-病理分期、肌層浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。這表明SPARC蛋白表達(dá)水平的下調(diào)可能是子宮內(nèi)膜癌病理進(jìn)程的分子標(biāo)志。由于SPARC表達(dá)易于用免疫組化的方法檢測(cè),使用于臨床可判斷腫瘤惡性程度及患者預(yù)后。對(duì) SPARC低表達(dá)或表達(dá)缺失者,需加強(qiáng)術(shù)后輔助治療,并嚴(yán)密隨訪。

上皮型鈣黏素屬于鈣依賴(lài)的黏附素家族成員, 它的生物學(xué)功能主要是介導(dǎo)同型細(xì)胞間的連接來(lái)維持正常上皮細(xì)胞的形態(tài)、促進(jìn)細(xì)胞間黏附及具有保持上皮細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定的功能，因此表達(dá)下降時(shí)細(xì)胞黏附作用減弱,使得腫瘤細(xì)胞易于脫離原發(fā)灶; 細(xì)胞表型改變, 獲得侵襲性生長(zhǎng)特性[10]。研究表明在胃癌[11]、卵巢癌[12]及非小細(xì)胞肺癌[13]中出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象，且表達(dá)下調(diào)的E-cadherin亦與惡性腫瘤的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移密不可分。本研究結(jié)果顯示, 在子宮內(nèi)膜癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于正常子宮內(nèi)膜、單純型增生、復(fù)雜型增生、不典型增生子宮內(nèi)膜組織(P<0.05)，且其低表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌組織病理學(xué)分級(jí)、手術(shù)-病理分期、肌層浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，因此其表達(dá)下降與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。

轉(zhuǎn)錄抑制因子增強(qiáng)子屬于PcG 家族成員之一。EZH2參與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)形成和基因表達(dá)調(diào)節(jié)。近年來(lái)研究表明EZH2基因在人類(lèi)多種腫瘤中高表達(dá), 與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。如前列腺癌[14]、乳腺癌[15]、淋巴瘤[16]中均為高表達(dá)。本研究結(jié)果顯示EZH2在子宮內(nèi)膜癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常子宮內(nèi)膜、單純型增生、復(fù)雜型增生、不典型增生子宮內(nèi)膜組織(P<0.05), 其高表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌組織病理學(xué)分級(jí)、手術(shù)-病理分期、肌層浸潤(rùn)深度有關(guān)(P<0.05)，與有無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P>0.05)。與淋巴轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)的原因也可能與研究樣本有限有關(guān)，故有待于擴(kuò)大樣本量后進(jìn)一步研究。

本研究顯示子宮內(nèi)膜癌中SPARC、E-cadherin在子宮內(nèi)膜癌組織中低表達(dá)，EZH2在子宮內(nèi)膜癌組織中的高表達(dá)。SPARC、E-cadherin隨著組織分化越差，手術(shù)分級(jí)越晚、肌層浸潤(rùn)越深、且伴有淋巴轉(zhuǎn)移，其表達(dá)呈下降趨勢(shì)。而EZH2隨著組織分化越差，手術(shù)分級(jí)越晚、肌層浸潤(rùn)越深、其表達(dá)呈上升趨勢(shì)，但與淋巴轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。SPARC與E-cadherin表達(dá)呈正相關(guān)性，與EZH2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，E-cadherin與EZH2呈負(fù)相關(guān)。這種復(fù)合表達(dá)反映不同信號(hào)傳導(dǎo)途徑的同時(shí)激活促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖與進(jìn)展。但這幾種基因蛋白相互調(diào)節(jié)的具體機(jī)制目前尚不清楚, 有待進(jìn)一步研究?？傊? 聯(lián)合檢測(cè)SPARC、E-cadherin與EZH2的表達(dá),可作為子宮內(nèi)膜癌早期診斷及預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移的生物潛能的生物學(xué)標(biāo)志, 對(duì)預(yù)后評(píng)估具有重要意義。

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