孫朝暉，楊慧蘭，危敏，林武榮，冼江

針對HSV-2 LAT ORF的siRNA在病毒潛伏激活中的作用

孫朝暉，楊慧蘭，危敏，林武榮，冼江

目的觀察皰疹病毒2型潛伏相關轉錄子開放閱讀框架(HSV-2 LAT ORF)在病毒潛伏感染激活中的作用。方法體外建立HSV-2潛伏感染及復發(fā)的神經細胞模型，對病毒在細胞中的潛伏和激發(fā)進行PCR驗證及測序；設計針對LAT ORF的siRNA，激活誘導后轉染SH-SY5Y細胞，檢測轉染前后LAT ORF的表達改變；制備HSV-2基因表達譜芯片，利用芯片分析抑制LAT ORF后病毒基因表達的改變。結果在人神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y上成功建立了HSV-2潛伏感染及激活的細胞模型，LAT、gG基因PCR擴增及電泳結果證實了病毒在細胞中的潛伏及激活；LAT ORF-siRNA轉染細胞24、36、48h后，LAT ORF mRNA的表達水平分別降低了39%、51%和60%?；蛐酒治龈蓴_后病毒基因表達，共有28個基因出現(xiàn)差異表達，其中24個基因下調，4個基因上調。結論LAT ORF在HSV-2潛伏感染激活中發(fā)揮了重要作用，為下一步分析LAT在病毒潛伏激活中的調控機制奠定了基礎。

皰疹病毒2型；病毒潛伏期；RNA干擾；寡核苷酸序列分析

皰疹病毒2型(HSV-2)是人類病毒性疾病的常見病原體之一，其潛伏感染及激發(fā)是生殖器皰疹易復發(fā)、難根治的主要原因。潛伏相關轉錄子(LAT)編碼蛋白在HSV感染的復發(fā)中起重要作用，是研究HSV感染復發(fā)過程中信號轉導途徑及特異性基因治療的理想靶標。本研究建立穩(wěn)定的HSV-2潛伏感染及激活細胞模型，并針對HSV-2 LAT 開放閱讀框架(ORF)區(qū)設計siRNA進行RNA干擾，觀察HSV-2 LAT ORF表達被抑制后病毒基因組表達的變化，探尋LAT ORF介導病毒潛伏激活的途徑。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 單鏈寡核苷酸接頭(SIP 5'-pGATCm CACACCAGCCAAACCCA-3'及SIR 5'-GGTTTGGCTGGTGTG-3')采用O ligo 6.0軟件設計，由G ib co公司進行合成、純化及SIP5'端磷酸化；RD-PCR通用引物U(5'-GTTTGGCTGGTGTGGATC-3')，Cy5標記的通用引物，分組引物UA、UT、UC、UG由本室自行合成；GenePix 4000B scanner購自美國GenePix科技有限公司。HSV-2 333標準株由中國預防醫(yī)學科學院病毒研究所提供，病毒復蘇后，接種Vero細胞單層增殖，測定病毒毒力[1]。人神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所，細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPM I 1640培養(yǎng)基中，生長至80%融合時進行傳代培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 HSV-2在SH-SY5Y細胞中潛伏感染模型的建立 棄掉舊培養(yǎng)液，加入0.25%胰酶消化液1～3m l，37℃消化細胞2～5m in，顯微鏡觀察貼壁細胞形狀變圓至脫離瓶壁，加等體積含10% FCS的RPM I 1640終止消化，500～1000r/m in離心1～2m in，棄上清，加入含10% FCS的RPM I 1640培養(yǎng)液，用吸管吹打使細胞懸浮，調整細胞數(shù)目至約1.0×105個/cm3，各加入1m l至24孔板中(2cm2/孔)，培養(yǎng)24h待細胞貼壁生長后，棄上清，加入含10% FCS的RPM I 1640培養(yǎng)液，加入60μmol/L無環(huán)鳥苷(ACV)100μl，培養(yǎng)過夜，吸去上清，將含有5MOI的病毒液100μl接種于孔板中，并于37℃吸附1h，加入含2.0% FCS的RPM I 1640維持培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.2 HSV-2在SH-SY5Y細胞中潛伏感染激發(fā)的誘導 在24孔板中，將潛伏感染8d的細胞放入溫度為43℃的水浴箱1.5h，相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.3 HSV-2在SH-SY5Y細胞中潛伏、激發(fā)的驗證 分別在H SV-2感染SH-SY 5Y細胞的第4、6、8天取24孔板培養(yǎng)上清進行PCR驗證；取感染后第8天24孔板，43℃加熱1.5h，取加熱完成后12、24、36h的上清進行PCR驗證。PCR引物：H SV-2 LAT基因上游引物5'-GCCAGACGTGCGTGCTCTGCACGAT-3'，下游引物5'-TGTTGGTCTTTATCATAGAACAGAG-3'，位置為基因組12 1 343－121 492，擴增條帶大小為15 0b p；H SV-2 gG基因上游引物5'-GACCCAAAGACGCACCCACA-3'，下游引物5'-CCAAGGCGACCAGACA AACG-3'，位置為基因組139、478～141、988，擴增條帶大小為412bp。采用測序儀測序并將結果與GenBank數(shù)據庫進行BLAST同源性比較。

1.2.4 針對LAT ORF基因的siRNA設計及合成參照GenBank中HSV-2 333株LAT基因的ORF序列(M 69065)，設計針對該序列的3對siRNA，其序列及在LAT基因ORF序列中的相對位置如表1所示，同時合成陰性對照siRNA。

表1 針對HSV-2 ORF的siRNA序列Tab.1 Sequences of the siRNAs targeting HSV-2 LAT ORF

1.2.5 siRNA轉染靶細胞 選擇加熱處理后的SHSY5Y細胞進行轉染實驗，具體操作按試劑說明進行。轉染實驗分為siRNA組、陰性對照組及空白對照組(未加siRNA及轉染試劑)，每組設3個復孔。siRNA 組每孔加入100μl轉染復合物(0.8μg siRNA溶于50μl RPM I 1640+2μl Lipofectam ine 2000溶于48μl RPM I 1640中)，陰性對照組每孔加入100μl轉染復合物(0.8μg陰性對照siRNA溶于50μl RPM I 1640+2μl Lipofectam ine 2000溶于48μl RPM I 1640中)，空白對照組每孔只加入100μl RPM I 1640。將24孔板放于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育4h，更換含10% FCS的RPM I 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉染24～72h后進行分析。

1.2.6 RT-PCR半定量檢測轉染前后HSV-2 ORF基因的表達 收集siRNA轉染前后細胞，用Trizol法提取細胞總RNA，DEPC水溶解后測定濃度及比值。37℃水浴DNaseⅠ消化痕量污染基因組DNA 2h后，利用引物oligo(dT)18、反轉錄酶AMV于42℃進行反轉錄，得到的反應液用于RT-PCR反應。

1.2.7 基因芯片探針制備 在Vero細胞中增殖HSV-2，取上清，采用限制性顯示技術(restriction disp lay，RD)制備探針，采用PAGE結合銀染法分離靶基因片段并進行3次PCR，具體方法參照文獻[2-4]進行。

1.2.8 芯片點樣與固定 加50% DMSO將探針濃度調整為300μg/m l，按編號順序依次加入384孔板。陽性對照探針選自經過測序驗證的痘苗病毒基因片段，陰性對照探針的基因片段來自人白細胞基因。芯片打印方式：每個陣列15×30，每個探針打3個點，共150條探針，其中2個GAPDH基因為陽性對照，10個水稻片段為陰性對照，5個50% DMSO為空白對照(圖1)。將芯片正面朝下置于3×SSC鹽水濕盒上方再水合化，然后迅速置入100℃溫箱中干燥，用紫外交聯(lián)儀以65m J的總能量進行交聯(lián)固定，以使探針共價交聯(lián)結合在玻片表面。樣品標記：分別取對照組及siRNA組細胞提取總RNA，反轉錄為cDNA，利用RD-PCR技術進行樣品標記[2-3]，對照組用Cy3進行標記，實驗組用Cy5進行標記。

圖1 芯片的打印點陣設計Fig.1 Design format of DNA microarray

1.3 統(tǒng)計學處理 采用Feature extraction 7.0軟件進行數(shù)據分析及標準化處理。

2 結 果

2.1 HSV-2在SH-SY5Y細胞中潛伏感染時的細胞形態(tài)觀察 從病毒接種第0天開始觀察細胞形態(tài)，至第14天，HSV-2在SY5Y細胞中均能保持潛伏狀態(tài)，細胞形態(tài)與正常細胞無明顯差異。第14天后，細胞出現(xiàn)較大量變圓、死亡現(xiàn)象。在本實驗中，HSV-2在SH-SY5Y細胞中最長可潛伏14d。

2.2 HSV-2潛伏感染SH-SY5Y細胞激活后的形態(tài)觀察 熒光倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的SH-SY5Y對照細胞呈單層生長，細胞呈多角形或梭形，細胞突起長而多，形成樹枝狀網絡(圖2A)。胞核圓形或橢圓形，有1～2個清晰的核仁，可見雙核細胞，胞質較豐富，易見分裂象細胞。24h出現(xiàn)灶性細胞病變，主要為細胞逐漸變圓、變大，核變大、核膜移位，折光性變差(圖2B)。48h病變范圍呈片狀擴大，可見多數(shù)細胞融合成多核巨細胞，染色體邊聚、核破碎(圖2C)。72h大部分細胞脫落，多核巨細胞裂解(圖2D)。

2.3 HSV-2在SH-SY5Y細胞中潛伏、激發(fā)的驗證在HSV-2潛伏感染SY5Y細胞的第4、6、8天，分別取上清進行PCR，結果顯示LAT基因均有表達，而編碼gG蛋白的基因未表達，提示處于病毒潛伏期(圖3A)。激活后12、24、36h，LAT基因及gG基因均有表達(圖3B)，提示病毒在細胞中已被激活，病毒基因組大量復制。將擴增出的PCR產物分別進行測序驗證，測序結果清晰，信噪比高，經BLAST比對與HSV-2 LAT及gG基因序列相符。

圖2 HSV-2潛伏感染SH-SY5Y細胞激活后的形態(tài)學改變(相差顯微鏡 ×200)Fig.2 Morphological changes of SH-SY5Y cells latently infected and reactivated w ith HSV-2(Phase contrast m icroscope ×200) A.Control; B.24h post-reactivation; C.48h post-reactivation; D.72h post-reactivation

圖3 HSV-2 gG、LAT基因PCR擴增產物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR products of HSV-2 LAT and gG geneM.DL2000 standard DNA ladder.A.1, 2, 3.gG gene on 4, 6, 8d post latent infection; 4, 5, 6.LAT gene on 8, 6, 4d post latent infection; B.1, 2, 3.gG gene on 12, 24, 36h post reactivation; 4, 5, 6 LAT gene on 12, 24, 36h post reactivation

2.4 siRNA對LAT mRNA基因表達的影響 從圖4可見，空白、陰性對照組LAT mRNA表達量基本無差異，但LAT ORF-siRNA轉染后細胞的mRNA表達明顯減少。490bp處為內參照GAPDH的特異擴增條帶，150bp處為LAT的特異性擴增條帶。采用UV凝膠圖像分析儀分析電泳結果，轉染后24、36和48h，LAT ORF mRNA的表達量分別降低了39%、51%和60%。

圖4 LAT ORF mRNA RT-PCR凝膠電泳圖Fig.4 Electrophoresis of the RT-PCR products of LAT ORF mRNAM.DL 2000; 1.Blank control; 2.Negative control; 3.24h after transfection; 4.36h after transfection; 5.48h after transfection

2.5 探針RD-PCR的制備 PAGE結合銀染法可清晰顯示HSV-2的RD片段(圖5)，每組平均有7～10條清楚的DNA帶，片段長度主要分布在250～750bp。

圖5 HSV-2 RD-PCR PAGE結合銀染法分組圖譜Fig.5 RD-PCR patterns of HSV-2 genes, PCR products separated by electrophoresis and stained with sliverM.Marker; 1-10.Positive clones of HSV-2 RD production

2.6 HSV-2 RD產物陽性克隆的PCR鑒定 干膠片切膠回收后，進行3次PCR，HSV-2 PCR產物AT克隆得到的陽性克隆，用pMD 18-T載體引物進行PCR擴增，并行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果見圖6。從電泳圖可見擴增條帶單一清晰，大小200～800bp。將擴增出的PCR產物分別進行測序驗證，測序結果清晰，信噪比高，經BLAST比對與HSV-2基因序列相符。

2.7 樣品與芯片雜交后的掃描結果 Cy3標記對照組HSV-2 mRNA，Cy5標記siRNA組HSV-2 mRNA。由紅色至藍色表示信號由強至弱。將Cy3和Cy5掃描圖像完全重疊后，紅色表示高表達，綠色表示低表達，黃色表示表達水平無改變(圖7)。

圖6 HSV-2 RD產物陽性克隆的PCR鑒定Fig.6 Identification of the positive clone of the RD product of HSV-2M.Marker; 1-10.Positive clones of HSV-2 RD production

圖7 芯片雜交結果(90%激光強度和70%增益值)Fig.7 Hybridization results of microarray (90% laser energy and 70% GMT)

2.8 雜交結果分析 對重復雜交的兩張芯片array1、array2結果進行分析，計算每點的平均熒光信號強度，運用SPSS 10.0軟件進行相關性分析，并繪制散點圖，結果顯示相關系數(shù)為0.986，P＜0.001，表明芯片重復性較好。

2.9 差異表達基因 采用QuantArray軟件分析RD標記的芯片雜交圖中Cy3和Cy5兩種熒光信號的強度及其比值。結果顯示，大部分基因表達下調，只有少數(shù)表達上調的基因。siRNA組與對照組比較，探針雜交信號Cy5/Cy3比值(array ration)＞2.0表示基因高表達，＜0.5表示基因低表達，進一步分析共有28個基因表達發(fā)生了較為明顯的表達變化，其中24個基因上調，4個基因下調，表2列出了部分差異表達基因。

表2 差異表達的部分HSV-2基因Tab.2 Differential expression gene of HSV-2

3 討 論

HSV-2病毒基因組為線性雙鏈DNA分子，大小約為152kb，由共價連接的長片段(L)和短片段(S)組成，兩者分別占病毒DNA的82%和18%，每一片段由中間的獨特序列(U)和兩端的倒置重復序列組成。HSV-2的主要LAT內的3個ORF分別被命名為ORF1、ORF2和ORF3，各含有214、74和119個密碼子，其ATG分別位于HSV-2主要LAT序列的第784、1267和1496位堿基上。我們在設計siRNA過程中選出3個序列，分別針對HSV-2的3個ORF，從實驗結果來看取得了較強的沉默效果，轉染后24、36、48h，LAT ORF mRNA表達水平分別下降了39%、51%和60%。細胞形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，siRNA轉染組在加熱處理后20～22h開始出現(xiàn)細胞裂解反應，較對照組晚3～5h，但兩組細胞形態(tài)變化基本一致。

診斷芯片探針的制備一般通過以下兩種途徑實現(xiàn)：①分子克隆結合PCR擴增基因片段；②在DNA合成儀上人工合成寡核苷酸片段。后者合成大量探針成本高，且長度超過70bp的錯配率明顯增加[4-5]。為此，本實驗采用的是前一種方法。RD技術采用限制性內切酶Sau3AⅠ切割cDNA，然后接上互補接頭，再根據接頭序列設計通用引物及其3'端延伸若干個堿基的選擇性引物進行PCR擴增，使擴增產物有序歸類，最后通過電泳顯示擴增片段，切膠、3次PCR分離基因片段，可以高效地分離到多個基因片段。在進行分組PCR時，某些組會出現(xiàn)分離片段大小接近而無法用普通瓊脂糖凝膠電泳分離的情況，我們利用5%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳結束后銀染顯色。

對HSV-2 LAT ORF進行干擾后分析差異表達基因，結果顯示ICP0表達明顯下調(表2)。ICP0具有泛素連接酶E3 (enzyme 3，E3)功能域，可通過多種途徑調控病毒基因組及宿主細胞中的基因轉錄，在調控裂解性感染與潛伏性感染平衡過程中起重要作用[6]。ICP0由編碼1～19、20～241、242～775密碼子的3個外顯子構成的mRNA翻譯而來，共含有775個氨基酸殘基，可導致特定核結構ND10的降解，與其刺激病毒感染以及激活轉錄密切相關[7]。另外，ICP0與去乙酰酶(HDAC)4、5、7氨基端之間的相互作用抵消了HDAC氨基端相關的抑制活性，明顯地增加了轉錄活性[8]。除ND10、HDACs外，ICP0還可通過與轉錄因子BMAL1相互作用而激活轉錄[9]。自1991年Doerig等[10]首次采用免疫細胞化學及Western blotting方法發(fā)現(xiàn)并證實了HSV LAT編碼蛋白的存在后，進一步研究顯示，LAT蛋白對病毒潛伏及再激活有重要意義，能編碼對病毒激活起促進作用的有生物活性的蛋白，對ICP0等起調節(jié)作用[11]。Thomas等[12]認為LAT ORF編碼一個約30kD的蛋白，功能類似ICP0，在病毒再激活的早期階段起作用，LAT ORF可以調節(jié)甚至替代ICP0在BHK和ND7細胞中的作用，該ORF的表達受嚴格調控，在潛伏感染時并不表達，而在一些能夠激活潛伏HSV的信號存在的條件下，才會被轉錄和翻譯。本研究結果顯示，對HSV LAT ORF進行干擾抑制后，降低了LAT對ICP0的調節(jié)功能，導致ICP0表達下降。

本研究對差異表達基因進行分析時還觀察到ICP4的表達上調。ICP4對于神經細胞從潛伏狀態(tài)中再激活也是必需的，它可以促進早期基因和晚期基因的表達。ICP4是由病毒編碼的磷蛋白，大小約85kD，在病毒感染期間，以同形二聚體的形式存在于感染細胞的胞核中。ICP4為E和L基因的轉錄激活所必需，LAT對ICP4有反向調節(jié)作用[13]，推測LAT mRNA受到抑制后ICP4表達上調；HSV-2激活過程中即刻早期基因IE的表達也分先后順序，首先為ICP0、LAT、ICP4等的表達，隨后為ICP27、VP16、RR等[14]，當病毒ICP0、LAT表達下調時，有可能引起ICP4代償性上調而繼續(xù)觸發(fā)激活。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)RNA干擾后胸苷激酶(TK)表達下調。有研究認為潛伏HSV在體內的再激活與TK有關[15]。TK由HSV早期基因E基因編碼合成，能使胸苷(T)或脫氧胞苷(dC)磷酸化。在處于增殖和生長期的細胞中，HSV DNA的復制不需要TK的活性，但是當細胞處于靜止期或血清饑餓時，HSV DNA的復制則有賴于TK的活性，因為TK的激酶活性可提高這些細胞中三磷酸胸腺啶(TTP)的水平。ICP22及VP16表達下調，這兩者共同參與HSV-2的基因轉錄調控[16]。ICP22分子量約68kD，主要定位于細胞核的多功能蛋白中，能夠影響一些細胞周期蛋白的活性和表達水平[17-18]。近期研究提示，ICP22與被感染細胞RNA polⅡ的磷酸化程度異常有關，提示ICP22在病毒DNA合成開始之前和之后發(fā)揮了不同的生物學功能[19]。同時，對HSV-1突變體的研究亦提示，ICP22在病毒基因轉錄水平上也具有重要的調節(jié)作用[20]。這一點得到了其他皰疹病毒家族成員，包括豬、馬、牛和水痘-帶狀皰疹病毒ICP22同源蛋白相關研究的支持[21]。這些ICP22同源蛋白均已被確認為轉錄調控因子[22]。VP16是病毒的一種內膜蛋白，ICP22對病毒α基因的轉錄調節(jié)作用可被VP16蛋白解除，而VP16發(fā)揮該作用依賴于α基因上游的特定序列，表明ICP22與VP16之間存在某種分子生物學的關聯(lián)，兩者可能作為一對調節(jié)因子對α基因轉錄進行協(xié)同調控。有研究表明，VP16與宿主細胞因子Oct-1和HCF結合形成VP16誘導復合物，該復合物與病毒α基因啟動子區(qū)通用轉錄激活元件TAATGARAT結合，繼而VP16羧基端高效的激活功能域可募集相應的細胞轉錄因子激活α基因轉錄[23-24]。VP16通過形成誘導復合物錨定于啟動子區(qū)并與相應轉錄因子作用，從而行使其轉錄激活功能。ICP22與轉錄復合物中各種轉錄因子存在相互作用，可推測VP16和ICP22對α基因的轉錄協(xié)同調控可能是通過二者與轉錄復合物中相關蛋白因子的某種未知作用實現(xiàn)的。對LAT ORF的抑制引起ICP22及VP16的下調是否由于ICP0的下調或是其他通路引起，還有待于進一步研究證實。

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Effects of siRNA targeting HSV-2 LAT ORF on the virus latency and reactivation

SUN Zhao-hui1, YANG Hui-lan1, WEI M in2, LIN Wu-rong3, XIAN Jiang11Department of Clinical Laboratory, General Hospital of Guangzhou Command, Guangzhou 510010, China
2Institute of Genetic Engineering, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
3Department of Clinical Laboratory, Lanhe Hospital of Nansha District, Guangzhou 511480, China

ObjectiveTo observe the role of open reading frame (ORF) of herpes virus 2 (HSV-2) latency associated transcript (LAT) in reactivation of latent virus infection.MethodsThe neural cell model of HSV-2 latent infection and reactivation in SH-SY5Y cells was established.PCR was used to authenticate the latency and reactivation of HSV-2 and then sequenced.siRNAs targeting the mRNA of HSV LAT ORF were designed and transfected into SH-SY5Y cells through Lipofectam ineTM2000 reagent.The expression of LAT ORF mRNA before and after transfection was assayed by RT-PCR.cDNA m icroarray was prepared to study the changes of gene expression profiles of HSV-2 after inhibition of LAT ORF mRNA.ResultsThe neural cell model system of HSV-2 latent infection and reactivation was established successfully in SH-SY5Y cells.PCR results of LAT and gG genes proved the latency and reactivation of virus.The mRNA expression of LAT ORF in the cells treated by HSV LAT ORF-siRNA at 24, 36 and 48h were significantly reduced by 39%, 51% and 60%, respectively.After hybridization, a statistic analysis following microarray scanning showed that 28 genes differentially expressed in the LAT-siRNA transfected cells as contrast to untransfected cells.An increase of expression was found in 4 genes and a decrease in 24.ConclusionLAT ORF plays an important role in the reactivation of HSV-2 latent infection, and it provides a foundation for understanding the regulatory mechanism of LAT in latent infection and reactivation of HSV-2.

herpesvirus 2; virus latency; RNA interference; oligonucleotide array sequence analysis

R373-33

0577-7402(2014)02-0109-07

10.11855/j.issn.0577-7402.2014.02.06

2013-08-17

2013-10-29)

(責任編輯：李恩江)

This work was supported by the Science and Technology Plan of Guangdong Province (2011B061300021)

廣東省科技計劃項目(2011B061300021)

孫朝暉，醫(yī)學博士，主任技師。主要從事病毒功能基因組學方面的研究

510010 廣州 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院檢驗科(孫朝暉、楊慧蘭、冼江)；510515 廣州 南方醫(yī)科大學基因工程研究所(危敏)；511480 廣州 廣州南沙欖核醫(yī)院檢驗科(林武榮)