周璞，刁鑫偉，湯金梁，彭麗娜，張洪川，陳正堂

肺癌是當(dāng)今世界發(fā)病率和病死率均居首位的惡性腫瘤[1]，雖然綜合治療水平不斷提高，但患者5年生存率并無(wú)明顯改善[2-3]。對(duì)肺癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的深入研究可幫助我們尋找更好的治療切入點(diǎn)。Rab25屬于Rab蛋白家族，在調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖分化、囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞骨架形成、胞吞作用等方面均發(fā)揮重要作用，特別是在調(diào)控細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸方面起著關(guān)鍵的分子開(kāi)關(guān)作用[4]。多項(xiàng)研究證實(shí)Rab25與腫瘤關(guān)系非常密切，它既是促癌因子又是抑癌因子[5-6]。本研究小組前期工作發(fā)現(xiàn)，在人肺腺癌干細(xì)胞表達(dá)上調(diào)的原癌基因中，Rab25上調(diào)倍數(shù)最大。本研究通過(guò)免疫組化法檢測(cè)Rab25蛋白在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中的表達(dá)，并分析其與NSCLC臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究Rab25在NSCLC中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 收集2009年1月－2010年6月第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的NSCLC石蠟組織標(biāo)本61例，癌旁組織40例。所有患者臨床資料完整，術(shù)前均未接受過(guò)放化療、生物治療及其他治療。術(shù)后立即切取標(biāo)本，其中男45例，女16例，年齡56.2±9.1(33～72)歲，中位年齡58歲；鱗癌31例，腺癌26例，腺鱗癌4例；TNM分期Ⅰ期30例，Ⅱ－Ⅲ期31例。本研究通過(guò)第三軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 Rab25鼠單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，山羊抗鼠二抗及免疫組化試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化檢測(cè)Rab25蛋白表達(dá) 采用兩步法(MaxVisionTM)，步驟如下：所有標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛固定，石蠟包埋，2μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，3%過(guò)氧化氫封閉13min后置于檸檬酸緩沖液進(jìn)行高壓修復(fù)，冷卻；滴加Rab25鼠單克隆抗體(1:500)，4℃孵育過(guò)夜；次日取出，37℃復(fù)溫；加入過(guò)氧化物結(jié)合的山羊抗鼠二抗，室溫孵育15min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，光學(xué)顯微鏡下檢測(cè)并拍照。染色結(jié)果根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)進(jìn)行分級(jí)，每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)視野觀察100個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；細(xì)胞染色強(qiáng)度：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色及深黃色為2分，褐色及深褐色為3分。陽(yáng)性強(qiáng)度為兩種積分乘積：0分為陰性(－)，1～4分為弱陽(yáng)性()，5～8分為中度陽(yáng)性()，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性。最后積分＜6分定義為低表達(dá)，≥6分為高表達(dá)。結(jié)果判定由兩位病理科醫(yī)師按照雙盲、獨(dú)立的原則進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以行×列表資料χ2檢驗(yàn)及校正χ2檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)分析NSCLC與癌旁組織Rab25的表達(dá)差異，及Rab25表達(dá)與臨床病理因素(性別、年齡，腫瘤大小、病理類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期)的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Rab25蛋白的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，在NSCLC的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中均有Rab25表達(dá)，但細(xì)胞核中無(wú)表達(dá)(圖1)。61例NSCLC組織中Rab25的陽(yáng)性表達(dá)率為93.4%(57/61)，40例癌旁組織中Rab25的陽(yáng)性表達(dá)率為27.5%(11/40)，兩者表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，表1)。

2.2 Rab25蛋白表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系Rab25蛋白在患者性別、年齡、有無(wú)吸煙、組織類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。腫瘤體積≥4cm患者的Rab25蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于腫瘤體積＜4cm的患者(48.5%vs 21.4%，P=0.028)。Ⅱ－Ⅲ期患者Rab25蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于Ⅰ期患者(48.4% vs 23.3%，P=0.042，表2)。

圖1 NSCLC組織與癌旁組織中Rab25蛋白的表達(dá)(免疫組化)Fig. 1 Expression of Rab25 protein in NSCLC and adjacent normal tissues(Immunohistochemical staining)

表1 Rab25蛋白在NSCLC和癌旁組織中的表達(dá)Tab.1 Expression of Rab25 protein in NSCLC and adjacent normal lung tissue

表2 Rab25蛋白表達(dá)與NSCLC患者臨床病理因素相關(guān)性(n=61)Tab.2 Correlation of the expression of Rab25 protein and clinicopathological factors of NSCLC patients(n=61)

3 討 論

癌癥的發(fā)生發(fā)展是多個(gè)促癌基因激活和抑癌基因失活的過(guò)程，尋找腫瘤相關(guān)基因并研究其作用機(jī)制，可更好地闡明腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，為治療腫瘤探尋新的道路。基因Rab25位于人染色體1q22，橫跨9kb，僅在胃腸黏膜、肺、腎等上皮組織中表達(dá)。Rab25蛋白為小GTP結(jié)合蛋白，在細(xì)胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)中起分子開(kāi)關(guān)的作用，并與GTP的結(jié)合和水解相偶聯(lián)[7]。目前多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，Rab25在肝癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺侵襲癌、卵巢癌等多種腫瘤中高表達(dá)，在腫瘤發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中起重要作用，并與患者不良預(yù)后密切相關(guān)[8-11]。但是，在激素不敏感型乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中，Rab25卻扮演抑癌因子的角色，確切機(jī)制尚不明確[12-13]。本課題組前期研究采用基因芯片技術(shù)篩選人正常肺干細(xì)胞和肺腺癌干細(xì)胞差異表達(dá)的基因，結(jié)果顯示在表達(dá)上調(diào)的11個(gè)原癌基因中Rab25上調(diào)最高，為18.1倍[14]。因此，推測(cè)Rab25可能在NSCLC中亦發(fā)揮重要作用，但目前國(guó)內(nèi)外鮮有相關(guān)研究報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，Rab25在NSCLC組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織(93.4% vs 27.5%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，可見(jiàn)在NSCLC中Rab25存在異常高表達(dá)，與我們前期研究結(jié)果較為一致。而且，NSCLC腫瘤體積≥4cm患者的Rab25陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于體積＜4cm的NSCLC患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028)，推測(cè)在NSCLC中Rab25可促進(jìn)腫瘤增殖，發(fā)揮促癌因子作用。已有多項(xiàng)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在多種腫瘤細(xì)胞中上調(diào)Rab25表達(dá)，可使細(xì)胞群增殖和存活顯著提高，采用小干擾RNA下調(diào)Rab25表達(dá)，可使細(xì)胞凋亡增加，侵襲黏附能力下降[15-17]。Cheng等[18]最新研究發(fā)現(xiàn)，Rab25不僅能下調(diào)凋亡蛋白BAX和BAK，激活PI3K-Akt信號(hào)通路，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和減少凋亡，還能增加癌細(xì)胞內(nèi)糖原儲(chǔ)備，在營(yíng)養(yǎng)缺乏的情況下可減輕細(xì)胞生物能量學(xué)壓力。

此外，Rab25可通過(guò)控制囊泡運(yùn)輸及與整合素α5β1相互作用，加速腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[19-20]。在人卵巢腫瘤細(xì)胞A2780中，Rab25直接作用于遷移細(xì)胞偽足頂端整合素α5β1的β亞基，增強(qiáng)癌細(xì)胞穿透基質(zhì)的能力，促進(jìn)細(xì)胞在含有纖維連接蛋白的3D基質(zhì)中的侵襲轉(zhuǎn)移[20]。多項(xiàng)臨床試驗(yàn)[5]也證實(shí)，Rab25高表達(dá)和乳腺癌、卵巢癌等患者的低生存率和不良預(yù)后密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NSCLCⅡ－Ⅲ期患者Rab25陽(yáng)性表達(dá)率高于Ⅰ期患者(48.4% vs 23.3%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.042)，可見(jiàn)Rab25高表達(dá)促進(jìn)了NSCLC的惡性生物學(xué)行為，并且可能成為判斷患者不良預(yù)后和生存期的指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)對(duì)深入研究Rab25在NSCLC中的作用及機(jī)制，進(jìn)一步發(fā)掘更多運(yùn)輸?shù)鞍自谀[瘤中的重要功能奠定了基礎(chǔ)，為腫瘤治療提供了新的思路。

[1]Spiro SG, Tanner NT, Silvestri GA, et al. Lung cancer: progress in diagnosis, staging and therapy[J]. Respirology, 2010, 15 (1):44-50.

[2]Ge CL, Li XY, Shang K, et al. Risk factors for prediction of outcome of non-small lung cancer[J]. J Zhengzhou Univ (Med Sci), 2011, 46(2): 216-219.[葛辰蕾, 李醒亞, 尚可, 等. 非小細(xì)胞肺癌預(yù)后影響因素分析[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2011, 46(2): 216-219.]

[3]Cui Y, Qi DL. Now and future: Erlotinib for treatment-resistant lung cancer[J]. Tianjin Med J, 2012, 40(10): 93-96.[崔焱，齊大亮. 厄洛替尼 耐藥型肺癌治療的現(xiàn)狀與展望[J]. 天津醫(yī)藥, 2012, 40(10): 93-96.]

[4]Mitra S, Cheng KW, Mills GB. Rab GTPases implicated in inherited and acquired disorders[J]. Semin Cell Dev Biol, 2011,22 (1): 57-68.

[5]Agarwal R, Jurisica I, Mills GB, et al. The emerging role of the RAB25 small GTPase in cancer[J]. Traffic, 2009, 10 (11): 1561-1568.

[6]Hutagalung AH, Novick PJ. Role of Rab GTPases in membrane traffic and cell physiology[J]. Physiol Rev, 2011 (91): 119-149.

[7]Agola J, Jim P, Ward H, et al. Rab GTPases as regulators of endocytosis, targets of disease and therapeutic opportunities[J].Clin Genet, 2011 (80): 305-318.

[8]Cao C, Lu C, Xu J, et al. Expression of Rab25 correlates with the invasion and metastasis of gastric cancer[J]. Chin J Cancer Res,2013, 25 (2): 192-199.

[9]Zhang JX, Wei J, Lu J, et al. Overexpression of Rab25 contributes to metastasis of bladder cancer through induction of epithelialmesenchymal transition and activation of Akt/GSK-3β/Snail signaling[J]. Carcinogenesis, 2013, 34 (10): 2401-2408.

[10]Yin YX, Shen F, Pei H, et al. Increased expression of Rab25 in breast cancer correlates with lymphatic metastasis[J]. Tumour Biol, 2012, 33(5): 1581-1587.

[11]Amornphimoltham P, Rechache K, Thompson J, et al. Rab25 regulates invasion and metastasis in head and neck cancer[J].Clin Cancer Res, 2013, 19(6): 1375-1388.

[12]Goldenring JR, Nam KT. Rab25 as a tumour suppressor in colon carcinogenesis[J]. Br J Cancer, 2011, 104 (1): 33-36.

[13]Cheng JM, Volk L, Janaki DK, et al. Tumor suppressor function of Rab25 in triple-negative breast cancer[J]. Int J Cancer, 2010,126 (12): 2799-2812.

[14]Luo FK, Zhao ZG, Zhao WP, et al. Analysis of the different gene expression profiles between lung adenocarcinoma stem cells and normal lung stem cells with cDNA microarrays[J]. Chin J Blood Transfusion, 2009, 22(4): 269-274. [羅?？? 趙正國(guó), 陳正堂,等. 基因表達(dá)譜芯片分析人肺腺癌干細(xì)胞與肺正常干細(xì)胞的差異基因表達(dá)[J]. 中國(guó)輸血雜志, 2009, 22 (4): 269-274.]

[15]Fan Y, Xin XY, Chen BL, et al. Knockdown of Rab25 expression by RNAi inhibits growth of human epithelial ovarian cancer cells in vitro and in vivo[J]. Pathology, 2006, 38 (6): 561-567.

[16]Lapierre LA, Caldwell CM, Higginbotham JN, et al.Transformation of rat intestinal epithelial cells by overexpression of Rab25 is microtubule dependent[J]. Cytoskeleton, 2011,68(2): 97-111.

[17]Liu Y, Tao X, Jia L, et al. Knockdown of Rab25 promotes autophagy and inhibits cell growth in ovarian cancer cells[J].Mol Med Rep, 2012, 6 (5): 1006-1012.

[18]Cheng KW, Agarwal R, Mitra S, et al. Rab25 increases cellular ATP and glycogen stores protecting cancer cells from bioenergetic stress[J]. EMBO Mol Med, 2012, 4 (2): 125-141.

[19]Kessler D, Gruen GC, Heider D, et al. The action of small GTPases Rab11 and Rab25 in vesicle trafficking during cell migration[J]. Cell Physiol Biochem, 2012, 29 (5-6): 647-656.

[20]Dozynkiewicz MA, Jamieson NB, Macpherson I, et al. Rab25 and CLIC3 collaborate to promote integrin recycling from late endosomes/lysosomes and drive cancer progression[J]. Dev Cell, 2012, 22 (1):131-145.