王曉煒，姜云清，張成鴻

(1.大連醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院形態(tài)實驗室，116044，遼寧，大連;2.大連市結核病醫(yī)院檢驗科，116033，遼寧，大連)

0 引言

翼柄山萵苣(Lactura triangulataMaxim)又稱野生菜，為菊科苦苣菜屬2年生或多年生草本植物[1]，主要分布在我國的東北、華北等地，在遼寧地區(qū)的大連、本溪、寬甸等地也有分布，生長于山坡林下和林緣草地等環(huán)境[2－3]。在遼寧的南部地區(qū)，翼柄山萵苣的嫩莖葉是民間非常受歡迎并具有一定療效作用的野菜，市場上也有出售。由于翼柄山萵苣的適口性好，農(nóng)民飼養(yǎng)的豬、羊、兔、雞、鴨和鵝等畜禽，也都非常喜食翼柄山萵苣的嫩莖葉。幾十年前，有的農(nóng)民發(fā)現(xiàn)，把翼柄山萵苣作為青飼料喂飼畜禽，能降低發(fā)病率，有助于提高養(yǎng)殖效益。因此，多年來遼寧南部的大連等地區(qū)的人們一直在大量的采收翼柄山萵苣作為藥用食材，或者作為青飼料喂養(yǎng)畜禽。然而，由于所采收的翼柄山萵苣必須是幼苗才能食用或飼用，由此使野生翼柄山萵苣資源遭到了嚴重破壞。致使現(xiàn)今出現(xiàn)了不僅難以采收到食用或飼用的野生翼柄山萵苣幼苗，而且每年的8－10月連野生翼柄山萵苣的種子也無法采收到的現(xiàn)象。為保護野生資源和滿足栽培的需求，研究者對其進行了愈傷組織分化及試管苗培養(yǎng)的研究。盡管同屬植物已有毛脈山萵苣[4]、葉用萵苣[5－7]、結球萵苣[8]的研究報道，但卻未見翼柄山萵苣愈傷組織分化及試管苗培養(yǎng)培養(yǎng)的研究報告。

1 材料與方法

1.1 材料來源及預處理

5月下旬，將在大連金州西海岸草地上生長旺盛的翼柄山萵苣植株的地下部一次性澆透4 mg/L青霉素溶液，同時向植株的地上部噴灑3 mg/L青霉素與3 mg/L慶大霉素的混合溶液，進行預先滅菌處理。1 d后，將已經(jīng)預先滅菌、待做試驗材料的全株采回實驗室備用。

1.2 材料滅菌

將采回實驗室內(nèi)的植株葉柄、嫩莖和粗壯根分別剪成長2 cm左右的葉柄段、嫩莖段和粗壯根段，采用穿龍薯蕷研究[9]的方法進行材料的滅菌，就會獲得無菌的葉柄段、嫩莖段和粗壯根段。

1.3 試驗方法

1.3.1 愈傷組織培養(yǎng) 將無菌材料段從滅菌瓶中取出后，放到無菌濾紙上，在吸干多余水分的同時，將無菌材料段兩端分別切掉0.5 cm左右，使其形成長約1 cm、兩端具有新鮮切口的葉柄段、嫩莖段和粗壯根段，并接種到以下6種培養(yǎng)上培養(yǎng):1)1/4 MS+瓊脂4.6 g/L+蔗糖34 g/L+ZT 0.7 mg/L+NAA 2.2 mg/L;2)1/4 MS+ 瓊脂 4.6 g/L+蔗糖34 g/L+ZT 0.7 mg/L+IAA 2.2 mg/L;3)1/4 MS+瓊脂4.6 g/L+蔗糖 34 g/L+ZT 0.7 mg/L+2，4-D 2.2 mg/L;4)MS+ 瓊脂 4.6 g/L+蔗糖 34 g/L+ZT 0.7 mg/L+NAA 2.2 mg/L;5)MS+瓊脂4.6 g/L+ 蔗糖 34 g/L+ZT 0.7 mg/L+IAA 2.2 mg/L;6)MS+瓊脂4.6 g/L+蔗糖34 g/L+ZT 0.7 mg/L+2，4-D 2.2 mg/L。接種后，分別放到無光(以下稱暗培養(yǎng))和光照強度3 200 Lx(以下稱光培養(yǎng))的條件下培養(yǎng)。進行在不同培養(yǎng)基上、不同材料與光照條件對愈傷組織培養(yǎng)的影響試驗。試驗重復2次，每次重復間隔時間15 d，每種處理接種30個材料。

1.3.2 嫩莖愈傷組織的分化培養(yǎng) 把以上驗證培養(yǎng)獲得的74塊嫩綠色的顆粒狀愈傷組織，從培養(yǎng)瓶中取出后，在無菌培養(yǎng)皿中切成邊長約0.3 cm的塊狀，再接種到以MS+La(NO3)3·6H2O 0.5 mg/L+蔗糖36 g/L+瓊脂0.52 g%和 MS+La(NO3)3·6H2O 0.5 mg/L+蔗糖36 g/L+瓊脂0.52 g%+6-BA 0.5 mg/L 2 種培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加濃度分別為0.01mg/L、0.05mg/L、0.10 mg/L、0.15 mg/L、0.20 mg/L、0.25 mg/L、0.30 mg/L、0.35 mg/L、0.40 mg/L 的 IAA 和 NAA培養(yǎng)基上，再放到無光照(以下簡稱暗培養(yǎng))、光照強度2 000 Lx(以下簡稱光培養(yǎng))和光照強度4 000 Lx(以下簡稱強光培養(yǎng))的條件下培養(yǎng)，進行不同基本培養(yǎng)基、不同生長素及光照條件對愈傷組織分化的影響試驗。該試驗重復了1次，每種處理培養(yǎng)40個愈傷組織塊。

1.3.3 生長芽試管苗培養(yǎng) 將驗證性試驗中獲得的362塊愈傷組織分化出的叢生生長芽，采用以下3種方法處理:1)將0.5 mg/L的IAA溶液倒入具有由愈傷組織分化叢生生長芽的培養(yǎng)瓶中，處理3 d后，將從生芽從基部剪下，使其形成單芽，再接種到1/2 MS+蔗糖14 g/L+瓊脂0.48 g不含生根劑的培養(yǎng)基上，進行生根培養(yǎng)(下稱方法1);2)將叢生生長芽從基部切下后，馬上把下部切口放到IAA 1.8 mg/L的溶液中處理10 min，再接種到1/3 MS+蔗糖36 g/L+瓊脂0.52g%+IAA 0.8 mg/L的培養(yǎng)基上，進行生根培養(yǎng)(下稱方法2);3)將叢生生長芽從基部剪下后，直接接種到1/3MS+蔗糖36 g/L+瓊脂0.52 g%+IAA 0.05 mg/L+NAA 0.15 mg/L 的培養(yǎng)基上，進行生根培養(yǎng)(下稱方法3)。該試驗重復1次，每一種處理接種培養(yǎng)200個生長芽。

1.3.4 試管苗移栽與定植 將2次生根試驗分別培養(yǎng)的186株和189株(共375株)試管苗，培養(yǎng)到第28 d時，從培養(yǎng)瓶中取出，直接移栽到上面為一層厚約7 cm礱糠灰的日光溫室苗床上。移栽后的前13 d要防止直射光照、保持18～30℃的溫度和80%以上的濕度。之后按照溫室內(nèi)條件正常管理。

移栽后第35 d，一次性將溫室內(nèi)移栽成活的326株試管苗定植到大連金州西海岸的草地上，除了初期澆2次透水外，其它按照野生條件進行管理。

2 結果與分析

2.1 不同材料、不同培養(yǎng)基及光照條件下對愈傷組織誘導培養(yǎng)的影響

接種后2個月觀察表明，所有暗培養(yǎng)的材料均不能生長出愈傷組織;而在光培養(yǎng)的條件下，只有在6)號培養(yǎng)基上培養(yǎng)的材料能不同程度的生長出愈傷組織。由表1可見，在6)號培養(yǎng)基上以嫩莖段為材料的培養(yǎng)效果最好。在這種培養(yǎng)基上，以嫩莖為材料培養(yǎng)到第8 d時有的嫩莖段切口處就生長出可見淡綠色、直徑0.1 cm左右的愈傷組織。隨著培養(yǎng)時間的延長，生長出愈傷組織的嫩莖段數(shù)不斷增加，愈傷組織塊越來越大，并且生長的愈傷組織也由最初的淡綠色轉化為嫩綠色的顆粒狀。在這一試驗的基礎上，將100個嫩莖段接種到6)號培養(yǎng)基上，進行了2次驗證試驗，結果2次驗證試驗分別有74個和76個嫩莖段生長出直徑0.9～2.2 cm的嫩綠色的顆粒狀愈傷組織。以上結果說明，在光照的條件下，MS+瓊脂4.6 g/L+ 蔗糖34 g/L+ZT 0.7 mg/L+2，4-D 2.2 mg/L這一培養(yǎng)基是翼柄山萵苣嫩莖愈傷組織培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基。

表1 6)號培養(yǎng)基上不同材料對愈傷組織生長的影響(3次試驗平均結果)

2.2 嫩莖愈傷組織的分化培養(yǎng)

2次愈傷組織的分化試驗結果證明:只有在以MS+La(NO3)3·6H2O 0.5 mg/L+蔗糖36 g/L+瓊脂0.52g%為基本培養(yǎng)基、附加不同濃度IAA和強光培養(yǎng)的條件下，培養(yǎng)的愈傷組織塊才能分化出生長芽，其余任何條件愈傷組織塊均不能分化。由表2顯示，IAA的濃度不同，分化的效果也不同。在附加濃度為0.05 mg/L IAA的培養(yǎng)基上，分化效果最好。對整個培養(yǎng)過程的觀察還發(fā)現(xiàn)，在IAA的濃度為0.05 mg/L的培養(yǎng)基上，愈傷組織塊分化時間早，分化的生長芽葉片伸展，呈叢生狀。在以上2次試驗的基礎上，又將400個愈傷組織塊1次性接種到以MS+La(NO3)3·6H2O 0.5 mg/L+蔗糖 36 g/L+ 瓊脂 0.52g%為基本培養(yǎng)基、附加濃度為0.05 mg/L的IAA培養(yǎng)基上，在光照的條件下進行分化的驗證性試驗，共有362塊愈傷組織分化出叢生生長芽，其它觀察統(tǒng)計的指標也獲得了與初期2次試驗幾近一致的結果。以上試驗說明:在光照強度4 000 Lx的條件下，翼柄山萵苣嫩莖愈傷組織生長芽分化培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基是MS+La(NO3)3·6H2O 0.5 mg/L+蔗糖 36 g/L+ 瓊脂 0.52g%+IAA 0.05 mg/L。

表2 不同濃度IAA對愈傷組織塊分化培養(yǎng)的影響

2.3 不同處理方法對生長芽試管苗培養(yǎng)的影響

用以上3種處理方法培養(yǎng)的生長芽，接種28 d統(tǒng)計，結果由表3所示:3種處理方法，培養(yǎng)的生長芽均能生根并生長成試管苗，但用方法3對生長芽進行處理，不僅生根率和試管苗平均生根條數(shù)遠遠好于方法1和方法2，而且對方法3的2次重復試驗共培養(yǎng)的375株試管苗的外觀長勢也很旺盛。上述結果說明，將叢生生長芽從基部剪下后，直接接種到1/3 MS+蔗糖36 g/L+瓊脂0.52g+IAA 0.05 mg/L+NAA 0.15 mg/L 的培養(yǎng)基上，進行生根培養(yǎng)的方法是翼柄山萵苣生長芽試管苗培養(yǎng)的理想方法;也就是說，1/3 MS+蔗糖36 g/L+瓊脂 0.52g%+IAA 0.05 mg/L+NAA 0.15 mg/L這種培養(yǎng)基是翼柄山萵苣生長芽試管苗培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基。

表3 不同處理方法對生長芽試管苗培養(yǎng)的影響(2次試驗平均結果)

2.4 試管苗移栽與定植

35 d后統(tǒng)計，移栽的375株試管苗，成活326株，成活率為86.9%。

定植后1個月統(tǒng)計，共成活并正常生長的試管苗為318株，定植成活率為97.5%。定植的試管苗根系發(fā)達，生長旺盛，翌年8月開花，野生翼柄山萵苣的植物學性狀都保持不變。

3 討論

在進行愈傷組織分化培養(yǎng)的試驗中，在附加了不同濃度的人工生長素NAA的培養(yǎng)基上，均未見愈傷組織分化;而在附加了9種不同濃度的天然生長素IAA的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)的愈傷組織均能不同程度分化。這一現(xiàn)象說明，雖然NAA是愈傷組織分化培養(yǎng)研究中較為常用的生長素[10]，但翼柄山萵苣愈傷組織的分化適宜生長素卻是天然生長素IAA。

盡管在培養(yǎng)基中附加了9種不同濃度的天然生長素IAA，培養(yǎng)的愈傷組織都能不同程度分化生長出生長芽，但在低濃度(0.05 mg/L)IAA培養(yǎng)基中分化培養(yǎng)的效果最好。這并不能說明翼柄山萵苣愈傷組織分化更需要低濃度(0.05 mg/L)的IAA，而實際情況是在分化培養(yǎng)過程中，嫩綠色的顆粒狀愈傷組織自身能合成部分天然生長素IAA，這不僅提高了天然生長素IAA的濃度，也促進了愈傷組織分化培養(yǎng)生長素的平衡，從而出現(xiàn)了理想分化培養(yǎng)效果。

注:本研究在遼寧省植物工程重點實驗室完成。

[1] 中國科學院植物研究所.中國高等植物圖鑒(第四冊)[M].北京:科學出版社，1975:692－692.

[2] 李書心.遼寧植物志(下冊)[M].沈陽:遼寧科學技術出版社，1991:614.

[3] 韓全忠，王正興.大連地區(qū)植物志(下冊)[M].大連:大連理工大學出版社，1993:809－810.

[4] 初冰，柳翀，呂卉，等.毛脈山萵苣再生體系建立的研究[J].農(nóng)業(yè)科技通訊，2010(1):73－76.

[5] 李丹，山洪艷，邵素清，等.美國葉用萵苣組織培養(yǎng)與植株再生[J].植物生理學通訊，2003，39(2):148－148.

[6] 孫月芳，黃劍華，陸瑞菊，等.葉用萵苣高頻再生體系建立[J].上海農(nóng)業(yè)學報，1998，14(3):17 －20.

[7] 朱路英，劉玲，孟祥棟，等.葉用萵苣離體培養(yǎng)和植株再生[J].園藝學報，2002，29(2):181 －182.

[8] 李鵬飛，郭碧霞.結球萵苣芽及葉片組織培養(yǎng)[J].華南農(nóng)學院學報，1980，1(3):233 －240.

[9] 張蕾蕾，李瑋，趙娜，等.穿龍薯蕷嫩莖高效無性系建立的研究[J].江西科學，2009，27(34).396－400.

[10] 安利佳，姜長陽.植物組織培養(yǎng)導論[M].大連:遼寧師范大學出版社，1996:62－67.