王東升，黃江麗，譚胤靜，田曉娟，張志紅，丁建南

(江西省科學(xué)院生物資源研究所，330096，南昌)

0 引言

近些年來，分子生物學(xué)技術(shù)在環(huán)境工程學(xué)、微生物生態(tài)學(xué)和環(huán)境生物學(xué)的研究中應(yīng)用越來越廣泛。例如，環(huán)境中土壤微生物功能基因的發(fā)掘和種群的分析與檢測(cè)等就主要是應(yīng)用分子生物學(xué)手段來研究，而提取高質(zhì)量的DNA是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的前提和基礎(chǔ)。已知土壤、特別是湖泊河流的沉積物中含有大量的腐殖質(zhì)，主要包括能溶于酸也溶于堿的富里酸(Fulvic Acids，F(xiàn)A)，溶于堿但不溶于酸的胡敏酸(Humic Acids，HA)和不溶于酸堿的胡敏素(Humin，HM)[1]，其中腐質(zhì)酸在沉積物DNA提取過程中不容易被去除，這些物質(zhì)可對(duì)后續(xù)的PCR擴(kuò)增、內(nèi)切酶消化、DNA雜交等實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生不利影響[2－3]，因而在沉積物微生物總DNA提取過程中去除腐質(zhì)酸尤為重要。然而，在現(xiàn)有土壤和沉積物總DNA提取的方法中，腐質(zhì)酸很難被完全去除，目前普遍采用并相對(duì)較好的方法主要是DNA提取試劑盒法和CTAB－SDS－凍融法[4－5]。本文以3種不同河口沉積物為研究對(duì)象，采用改進(jìn)的CTAB－SDS－凍融法和DNA提取試劑盒法提取DNA并加以分析比較，旨在建立一種適用于高含腐殖質(zhì)沉積物總DNA的提取方法，以期為后續(xù)的分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料1取自修河與贛江交匯處修河上游200 m處，沉積物呈黑色，腐殖質(zhì)含量非常高;實(shí)驗(yàn)材料2取自修河與贛江交匯處贛江上游150 m處，沉積物為黃色粘土，黃色色素含量高;實(shí)驗(yàn)材料3取自饒河進(jìn)入鄱陽湖的河口，沉積物主要以沙子為主。取上層0～3 cm的沉積物作為樣品，每個(gè)河口取6個(gè)點(diǎn)混合在一起。

1.2 主要試劑

脫腐殖酸緩沖液:參考魏斐[4]等改進(jìn)，100 mmol/L Tris，100 mmol/L Na4P2O7，100 mmol/L Na2EDTA，1.0% 聚乙烯吡咯烷酮 K30(PVP)，NaCl，0.05%Trition X－100，pH10.0，121 ℃ 高壓滅菌20 min。

CTAB溶液:由終濃度為 100 mM的 Tris－HCl，100 mM 的 EDTA，1.5 M 的 NaCl，1% 的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，1 mg/mL的溶菌酶和0.2 mg/mL的蛋白酶K組成(溶菌酶和蛋白酶K用時(shí)再加入)。

10%的十二烷基磺酸鈉(SDS);酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)。

洗滌緩沖液:0.33 mol Tris·HCl(pH8.0)，1 mmol EDTA·Na(pH8.0)。

核酸電泳緩沖液:1×TAE緩沖液。

DNA沉淀和洗滌試劑:異丙醇，無水乙醇。

1.3 河口沉積物總DNA提取方法

1.3.1 方法1 1)沉積物中微生物的細(xì)胞裂解:稱取1.5 g沉積物樣品，加3 mL CTAB溶液，渦旋充分混勻;在液氮和65℃水浴中反復(fù)凍融3次;在37℃下?lián)u30 min。2)DNA的分離:加10%的SDS至終濃度為2%，在65℃水浴中保溫1.5 h，每隔20 min顛倒混勻1次;室溫12 000 r/min離心10 min，收集上清;上清加等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，輕輕顛倒混勻;室溫12 000 r/min離心10 min，留上清;酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提3次;上清加等體積的異丙醇，沉淀1－2 h;在4℃下，以12 000 r/min離心10 min，棄上清;用70%的冰凍乙醇洗滌DNA沉淀，在4℃下，以12 000 r/min離心5 min，棄上清;70%的冰凍乙醇洗滌DNA沉淀3次，自然干燥;用100 μL TE(pH8.0)溶解 DNA沉淀，得到河口底泥總DNA粗提液。DNA跑0.8%的瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.2 方法2 1)沉積物的預(yù)處理:稱取15 g河口底泥放入50 mL離心管中，加入30 mL脫腐殖酸緩沖液，渦旋振蕩5 min，靜置2 min，在4℃下先2 500 r/min低速離心3 min，再10 000 r/min高速離心8 min，棄上清，取沉淀的上部1/2轉(zhuǎn)移到另一新的離心管中;重復(fù)上步2次，將得到1.5 g底泥轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中，再用脫腐殖酸緩沖液洗滌到無色為止;最后用洗滌緩沖液洗滌底泥2次。2)細(xì)胞裂解和DNA分離步驟與方法1相同。

1.3.3 方法3 1)樣品預(yù)處理方法與方法2相同;2)細(xì)胞裂解和DNA分離步驟與方法一相同;3)DNA重沉淀:DNA粗提液加1倍體積的冰凍異丙醇，在 －20℃下沉淀1.5 h;在4℃下，以12 000 r/min離心10 min，棄上清;沉淀用70%的冰凍乙醇洗滌，在4℃下，以12 000 r/min離心5 min，棄上清，本步驟重復(fù)2 次;用50 μL TE(pH8.0)溶解DNA沉淀，得到最終河口沉積物總DNA。1.3.4 方法4 沉積物總 DNA提取使用 ZOMANBIO公司的離心柱型超純土壤基因組DNA快速提取試劑盒，操作步驟見說明書。

1.4 提取的總DNA瓊脂糖凝膠電泳

提取的DNA樣品跑0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 DNA純度和產(chǎn)量檢測(cè)

用美國(guó)Nanodrop公司的ND－1000紫外分光光度法分別測(cè)定 DNA溶液的 OD230、OD260和OD280值。DNA濃度可以直接讀數(shù)，通過計(jì)算OD260/OD280(DNA/蛋白質(zhì))和OD260/OD230(DNA/腐殖酸)的比值來評(píng)價(jià)所提取DNA的純度[6]。

1.6 16S rDNA的PCR擴(kuò)增

以上述4種方法提取的沉積物總DNA為模板，用細(xì)菌16S rDNA 通用引物63F(5'－CAGGCCTAACACATGCAAGTC－3')和 1387R(5'－GGGCGGWGTGTACAAGGC－3')進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系:模板 DNA 1 μL，20 μM 的引物 63F 和1387R 各 1 μL，2 × EasyTaq PCR SuperMix 25 μL，加ddH2O到50 μL。PCR反應(yīng)參數(shù):95℃變性5 min;95℃變性35 s，54℃退火40 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物跑1%的瓊脂糖凝膠電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取的總DNA瓊脂糖電泳結(jié)果

如圖1所示，泳道1～12的DNA電泳圖譜條帶單一清晰，幾乎無拖尾現(xiàn)象，DNA片斷大小約23 130 bp，說明所提取的 DNA沒有斷裂。從DNA條帶的明亮程度來判斷，CTAB－SDS－凍融法和樣品預(yù)處理－CTAB－SDS－凍融法提取的DNA濃度高，沉積物樣品經(jīng)過預(yù)處理所提取的DNA濃度最高，而樣品預(yù)處理－CTAB－SDS－凍融－DNA 重沉淀法和土壤總DNA提取試劑盒法提取的DNA濃度較低。這說明方法3中DNA重沉淀會(huì)損失大量的DNA;土壤總DNA提取試劑盒的吸附柱能吸附的DNA量有限，大量的DNA沒能附著在吸附柱上;沉積物樣品經(jīng)過預(yù)處理去除了大量的腐殖酸，有利于提高DNA的回收率(如圖1中泳道1～6)。此外，由于沉積物樣品的不同，也會(huì)影響DNA的提取量，如圖1中泳道3、6比較暗，DNA含量少，主要是由于饒河沉積物多為沙子，含有微生物少，而泳道1、2和4、5比較亮，DNA含量多，它們分別為修河和贛江沉積物，沙子少，營(yíng)養(yǎng)多，含有微生物量也多。

2.2 DNA純度和產(chǎn)量檢測(cè)結(jié)果

圖1 沉積物總DNA的0.8%瓊脂糖凝膠電泳圖譜

在高含腐殖質(zhì)的沉積物DNA提取過程中，腐殖酸、酚類物質(zhì)、雜蛋白等難以去除干凈，一般通過檢測(cè) OD260/OD230和 OD260/OD280比值來評(píng)價(jià)DNA樣品的純度。腐殖酸在230 nm和260 nm處有吸收峰，OD260/OD230比值高(＞2)表示DNA較純，而比值低表明腐殖酸污染多;蛋白質(zhì)在280 nm處有吸收峰，OD260/OD280比值高(＞1.7)表示DNA較純，而比值低表明蛋白質(zhì)污染多[3]。

從表1中可以看出，方法1、2所得DNA樣品的OD260/OD230和OD260/OD280比值相對(duì)較小，說明其中蛋白質(zhì)、腐殖酸等雜質(zhì)成分較多，也可以看出方法2比方法1 DNA純度要高些，說明沉積物樣品經(jīng)過預(yù)處理后，對(duì)提取高質(zhì)量的DNA有好處，同時(shí)也能增加 DNA的提取量;方法3、4所得DNA樣品的OD260/OD230和OD260/OD280比值相對(duì)較高，說明其中蛋白質(zhì)、腐殖酸等雜質(zhì)成分較少，也可以看出方法3比方法4所得DNA的純度更高，說明DNA重沉淀對(duì)除去腐殖酸、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)作用顯著，但DNA重沉淀會(huì)導(dǎo)致DNA的大量損失，即便DNA有大量損失，還是比試劑盒提取的量要大;從表1中也可以看出，同一種方法不同沉積物樣品所得DNA純度和產(chǎn)量也不一樣，修河河口沉積物含有腐殖質(zhì)最多，最不容易去除，贛江河口沉積物的腐殖質(zhì)要少一些，饒河河口沉積物的腐殖質(zhì)最少，基本為沙子為主，不用對(duì)沉積物樣品進(jìn)行預(yù)處理就能提取質(zhì)量相對(duì)較高的DNA，但由于以沙子為主的沉積物營(yíng)養(yǎng)少，微生物含量也就少，最終提取的DNA產(chǎn)量也相對(duì)較少，但是用試劑盒提取方法中，饒河河口沉積物所得到的DNA量最多，推測(cè)是與DNA競(jìng)爭(zhēng)吸附柱的腐殖酸少的原故。腐殖酸與DNA有相似的物理化學(xué)性質(zhì)，在使用柱子進(jìn)行純化時(shí)腐殖酸與DNA競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合吸附位點(diǎn)[7]。

2.3 16S rDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

如圖2所示，泳道3、6、9、12能夠清晰的看到PCR擴(kuò)增16S rDNA得到約1 380 bp的目的片斷，說明饒河河口沉積物用這4種方法都可以提取到質(zhì)量能滿足PCR擴(kuò)增要求的DNA，因?yàn)樵摌悠匪迟|(zhì)少。泳道1、4、10都沒有PCR擴(kuò)增的目的片斷，只有泳道7有PCR擴(kuò)增的目的片斷，說明方法1、2、4提取的修河河口沉積物的DNA質(zhì)量不能滿足PCR擴(kuò)增條件，含有的雜質(zhì)太多，而方法3進(jìn)行了重沉淀DNA，去除了大量的DNA中的雜質(zhì)，使其達(dá)到了PCR擴(kuò)增的要求。泳道2、5沒有PCR擴(kuò)增的目的片斷，泳道8、11有PCR擴(kuò)增的目的片斷，說明方法1、2提取的贛江河口沉積物DNA質(zhì)量達(dá)不到PCR擴(kuò)增的要求，方法3、4提取的符合PCR擴(kuò)增要求。從DNA樣品上看，方法1提取的修河、贛江河口沉積物總DNA樣品顯褐色，方法2提取修河、贛江河口沉積物總DNA樣品顯黃色，方法4提取的修河河口沉積物總DNA樣品顯淺黃色，DNA樣品顏色的深淺代表含腐殖酸的多少，這些腐殖酸通過鰲合Mg2+抑制PCR關(guān)鍵酶Taq聚合酶的活性[8]。這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合，如圖2中的泳道1、2、4、5、10所示。

表1 4種方法提取的3種河口沉積物總DNA的純度和產(chǎn)量比較

結(jié)合表1數(shù)據(jù)，得出4種方法提取沉積物DNA的質(zhì)量由高到低的順序:方法3＞方法4＞方法2＞方法1。

圖2 沉積物總DNA的16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

通常提取DNA的方法主要包括兩大步驟:一是細(xì)胞裂解，二是DNA分離。但是對(duì)于土壤和沉積物提取DNA來說，只有細(xì)胞裂解和DNA分離這兩步還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，因?yàn)橥寥乐泻写罅康母乘?，污染腐殖酸的DNA不能進(jìn)行后續(xù)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。本文在沉積物總DNA提取方法中最常用且相對(duì)有效的CTAB－SDS－凍融法的基礎(chǔ)上，增加和改進(jìn)了去除DNA中腐殖酸的步驟。土壤樣品中的腐殖酸一般常用PVP和CTAB去除[9]，方法2用PVP去除沉積物樣品中的腐殖酸，結(jié)果比方法1沒有用PVP的效果要好，當(dāng)然CTAB也有很好的去除腐殖酸作用。但是，對(duì)于腐殖酸含量高的沉積物樣品來說，雖然沉積物樣品經(jīng)過預(yù)處理去除腐殖酸，其最后提取的DNA質(zhì)量仍然不高，達(dá)不到分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。因此，方法2所提取的DNA還必須經(jīng)過進(jìn)一步純化來去除腐殖酸。DNA純化最常用的方法為瓊脂糖凝膠電泳純化法和直接DNA吸附柱純化法[10]，這2種方法成本都比較高，瓊脂凝膠電泳純化法雖然效果好，但操作相對(duì)繁瑣，直接DNA吸附柱純化法腐殖酸會(huì)也與DNA競(jìng)爭(zhēng)吸附柱的吸附位點(diǎn)，純化效果也不理想。本文方法3純化DNA的方法是對(duì)DNA進(jìn)行重新沉淀，雖然會(huì)導(dǎo)致DNA的大量損失，但是比試劑盒法提取沉積物總DNA所得到的DNA產(chǎn)量更多、質(zhì)量更好。

綜上所述，河口沉積物總 DNA提取前，用PVP預(yù)處理沉積物樣品可以除去部分腐殖酸，對(duì)于含有大量腐殖質(zhì)的沉積物所提取的DNA還必須進(jìn)行純化，異丙醇重沉淀DNA的純化方法雖然會(huì)損失大量DNA，但是操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉，最重要的是可以獲得高質(zhì)量的DNA，為后續(xù)的分子學(xué)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

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