周婕 姚羚羚 靳先萍

腸道致病菌盲樣考核鑒定分析與質(zhì)量控制

周婕 姚羚羚 靳先萍

依據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.4-2010、GB/T4789.7-2008，采用傳統(tǒng)分離方法和血清學(xué)鑒定，聯(lián)合API20E細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)從混合盲樣考核樣本中分離出副溶血性弧菌，并對分離鑒定過程和微生物檢驗(yàn)的質(zhì)量控制進(jìn)行總結(jié)分析。

腸道致病菌；沙門氏菌；副溶血性弧菌；盲樣考核；質(zhì)量控制

為加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室能力建設(shè)和提高在以后的工作中應(yīng)對突發(fā)公共衛(wèi)生事件的能力，成都市溫江區(qū)疾病預(yù)防控制中心每年都會參加成都市疾病預(yù)防控制中心組織的微生物盲樣考核工作，以此驗(yàn)證微生物實(shí)驗(yàn)室的儀器性能，培養(yǎng)基試劑質(zhì)量和檢驗(yàn)人員的檢測能力。并從能力驗(yàn)證結(jié)果中找出自身與其它實(shí)驗(yàn)室間的差距，提升自身檢測能力?，F(xiàn)將2011年7月接受上級疾控中心盲樣考核檢測結(jié)果和檢測過程分析如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)控樣品來源 由成都市疾控中心發(fā)放的混合菌盲樣。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 本次實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基由杭州微生物、北京陸橋、法國科瑪嘉試劑提供，API20E鑒定系統(tǒng)由法國梅里埃提供，沙門氏診斷血清由寧波天潤提供。檢測過程中使用的培養(yǎng)基和試劑均在有效期內(nèi)，其生產(chǎn)廠家、批號、制備過程、驗(yàn)收貯存及使用前質(zhì)控等信息均可溯源。

1.2 方法[1]中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.4-2010、GB/T4789.7-2008。

1.2.1 增菌培養(yǎng) 取25mL樣品放入225mL BPW增菌液中充分振蕩混勻，放入培養(yǎng)箱中36℃增菌8h；另再取25mL樣品放入225mL 3%堿性胨水培養(yǎng)8h，再將培養(yǎng)8h后的BPW增菌液混合后，分別移取1mL轉(zhuǎn)種于10mL TTB和10mL SC增菌液中進(jìn)行培養(yǎng)。同時(shí)直接用樣品原液在選擇性平板上直接劃線分離，并在檢測過程中同步代入待檢菌標(biāo)準(zhǔn)菌株。

1.2.2 分離培養(yǎng) 挑取上述增菌液，分別接種于相應(yīng)的鑒別培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)24h（BS培養(yǎng)48h）后，觀察各個(gè)平板上菌落形態(tài)。

1.2.3 生化反應(yīng)及血清分型 挑取不同特征菌落涂片染色鏡檢，同時(shí)挑取各種不同可疑菌落純培養(yǎng)，再用純培養(yǎng)物作系統(tǒng)生化鑒定和血清學(xué)試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 鑒別培養(yǎng)基上生長情況及菌落特點(diǎn) 見表1。

2.2 初步鑒定 分別挑取平板上可疑菌落于3%TSA和普通營養(yǎng)瓊脂36℃純培養(yǎng)24h，并進(jìn)行革蘭氏染色，再挑取純培養(yǎng)的菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，進(jìn)行細(xì)菌的初步鑒定。

2.3 可疑副溶血弧菌系統(tǒng)生化鑒定

2.3.1 3%三糖鐵試驗(yàn)和氧化酶試驗(yàn) 可疑菌落在3%三糖鐵上表現(xiàn)為上紅下黃（-/+），硫化氫陰性，不產(chǎn)氣，氧化酶為陽性。

表1 鑒別培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及生長情況

2.3.2 嗜鹽試驗(yàn) 挑取3%三糖鐵上的單個(gè)菌落，分別接種于不同濃度的氯化鈉溶液中，36℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。在3%和7%的Nacl胰胨水中混濁生長旺盛，在無鹽胨水和10%的胰胨水不生長未混濁。

2.3.3 確定實(shí)驗(yàn) 取純培養(yǎng)的菌落，制成菌懸液，用API20E進(jìn)行鑒定，36℃培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。API20E試劑條生化反應(yīng)編碼為4346106，結(jié)果為Vibrio parahemolyticus，即為副溶血弧菌，鑒定百分率：99.9%，T=1.0。

2.4 可疑沙門氏菌系統(tǒng)生化鑒定

2.4.1 挑取6個(gè)BS平板上的墨綠色可疑菌落，接種三糖鐵、賴氨酸、氧化酶、尿素、靛基質(zhì)生化管，36℃培養(yǎng)24h觀察結(jié)果，三糖鐵反應(yīng)結(jié)果只有一種，具體生化反應(yīng)見表2。

表2 可疑菌株生化反應(yīng)結(jié)果

2.4.2 血清學(xué)試驗(yàn) 挑取三糖鐵上菌落做血清學(xué)試驗(yàn)，A-F多價(jià)不凝集（陰性），鹽水對照也為陰性。

2.4.3 確定試驗(yàn) 取純培養(yǎng)菌落，制成菌懸液，用API20E進(jìn)行鑒定，36℃培養(yǎng)24h觀察結(jié)果[2-3]。API20E試劑條生化反應(yīng)編碼為1604512，結(jié)果為Citrobacter youngae，即可排除沙門氏菌。

2.5 綜上，由生化和血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果可得，本次質(zhì)控考核檢出副溶血弧菌，未檢出沙門氏菌。

3 討論

參加室驗(yàn)室間質(zhì)控考核，可以增加檢驗(yàn)人員實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，提高檢測能力，在平常的食品微生物檢測工作中，很少能分離出致病菌，所以對致病菌的檢測缺少經(jīng)驗(yàn)，而質(zhì)控考核正好給了我們鍛煉的機(jī)會。對于樣品中有既目標(biāo)菌，又混入了幾種干擾菌的混合菌檢測，在進(jìn)行常規(guī)檢驗(yàn)步驟之前，最好先直接用樣品原液在相應(yīng)的選擇性平板上直接劃線分離，這樣做可以避免干擾菌生長過好而抑制了目標(biāo)菌的生長，也可以提前了解樣品中的目標(biāo)菌的種類，到底是一種還是兩種或是兩種菌都存在。

培養(yǎng)基的選擇也很重要，顯色培養(yǎng)基是一種新型分離培養(yǎng)基，利用它進(jìn)行微生物的篩選分離，其反應(yīng)的靈敏度和特異性大大優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)基，使菌落特征更容易判斷，大大提高了分離能力[3]。

平時(shí)做好實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制工作，如培養(yǎng)基和診斷血清的質(zhì)量控制、儀器的維護(hù)保養(yǎng)和檢定校準(zhǔn)、標(biāo)準(zhǔn)菌株的傳代和安全管理。注意實(shí)驗(yàn)室生物安全，質(zhì)控菌株多為致病菌，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后所有培養(yǎng)物都必須要經(jīng)過高壓滅菌處理[4-6]。

[1] GB4789.4-2010、GB/T4789.7-2008 《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)》[S].中華人民共和國衛(wèi)生部,2010.

[2] 慕萬志.2007年雙塔區(qū)腸道致病菌質(zhì)控盲樣檢測報(bào)告[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志，2008,24(6):94-95.

[3] 宋鳳燕,宋艷文.食源性致病菌質(zhì)控盲樣鑒定結(jié)果分析[J].職業(yè)與健康， 2010,8(23):60-61.

[4] 付冬蓮,袁國輝.一次微生物混合考核盲樣檢測分析[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012,30（6）:628-630.

[5] 楊一明.微生物質(zhì)控考核樣品的檢測分析與探討[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2011,8（23）:2941-2942.

[6] 張喜.商品微生物培養(yǎng)基質(zhì)量狀況及其控制[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2009,15 (16):37-38.

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.22.104

四川 611130 成都市溫江區(qū)疾病預(yù)防控制中心 （周婕 姚羚羚靳先萍）