馮燕翀+牛戰(zhàn)琴

[摘要]目的 探討JAM-1在不同肌層浸潤深度的子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及意義。方法 73例子宮內(nèi)膜癌患者，其中癌細(xì)胞無肌層浸潤18例，淺層浸潤38例，深層浸潤17例，采用免疫組化法檢測JAM-1在無、淺、深三組浸潤深度的表達(dá)情況。結(jié)果 JAM-1表達(dá)在子宮內(nèi)膜癌癌細(xì)胞、腺細(xì)胞的胞膜及胞漿，隨肌層浸潤程度的增加JAM-1的表達(dá)顯著減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 子宮內(nèi)膜癌JAM-1的表達(dá)與癌細(xì)胞的浸潤程度呈反比，提示JAM-1可能與子宮內(nèi)膜癌的浸潤、侵襲相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]子宮內(nèi)膜癌；連接黏附分子1；肌層浸潤

[中圖分類號] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）06-17-04

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma）是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，以腺癌最常見。是女性生殖系統(tǒng)的三大惡性腫瘤之一，占全身惡性腫瘤的7%～8%。近年來其發(fā)病率呈上升趨勢[1]。子宮內(nèi)膜癌在后期向肌層、宮頸、陰道侵潤，而肌層浸潤深度是影響子宮內(nèi)膜癌的因素之一。連接黏附分子1（junctional adhesion molecule 1，JAM-1）參與構(gòu)成上皮及內(nèi)皮間的緊密連接復(fù)合物，在腫瘤組織癌巢的形成、血管及淋巴管的新生過程中發(fā)揮一定的作用[2]。劉艷翠等[3]研究發(fā)現(xiàn)在小鼠胃癌組織中JAM-1表達(dá)降低，猜想JAM-1可能通過降低細(xì)胞間的黏附促進胃癌的轉(zhuǎn)移、侵襲。然而其在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中特別是子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)，與肌層侵潤深度的關(guān)系，是否參與腫瘤的侵襲、擴散目前尚無明確的報道。本文借助免疫組化

方法初步檢測JAM-1在不同肌層浸潤深度的子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)情況，探討其在腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，為疾病的診斷或防治提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集長治和平醫(yī)院2012年10月～2013年10月經(jīng)手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜癌患者 73例，平均年齡51歲，術(shù)后均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診，術(shù)前均未接受激素治療或放化療，且全身未合并糖尿病或其他腫瘤。參照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）制定的子宮內(nèi)膜癌手術(shù)病理分期將標(biāo)本分為三組：A組18例，腫瘤僅限于子宮內(nèi)膜無肌層浸潤；B組38例，腫瘤浸潤深度<1/2肌層為淺層浸潤；C組17例，腫瘤浸潤深度>1/2肌層為深層浸潤。A組平均年齡（51.4±10.1）歲，B組（50.7±10.4）歲，C組（49.9±10.7）歲，三組患者在年齡方面無顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。

1.2 試劑與設(shè)備

兔抗人JAM-1多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，即用型二抗試劑盒、加強型DAB顯色試劑盒由福州邁新生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，山羊血清封閉液購自武漢博士得生物技術(shù)有限公司，PBS緩沖液、枸櫞酸鹽修復(fù)液、顯微鏡、圖像采集及分析儀等由和平醫(yī)院病理科提供。

1.3 標(biāo)本處理

手術(shù)切除標(biāo)本固定在足量10%福爾馬林固定液，固定時間不小于2h，常規(guī)石蠟包埋，垂直子宮內(nèi)膜連續(xù)5μm切片。

1.4 實驗方法

實驗采用免疫酶法二步法檢測JAM-1在不同浸潤深度癌組織中的表達(dá)，參照試劑盒說明書進行試驗，主要操作步驟如下：切片以二甲苯脫蠟，梯級乙醇脫水，滴加3% H2O2 15min以阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶，PBS緩沖液清洗后加入枸櫞酸鹽溶液中加熱1分30秒，室溫冷卻，滴加山羊血清封閉液室溫孵育20min，甩掉封閉液滴加一抗（工作濃度為1∶200）后放入4℃冰箱中過夜。第2日PBS清洗切片后加過氧化物酶標(biāo)記二抗常溫下孵育15min，滴加二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，顯微鏡下觀察顯色，及時自來水終止。蘇木素復(fù)染，清水沖洗，連過3次二甲苯，梯度酒精脫水，通風(fēng)櫥中風(fēng)干，滴加中性樹膠，蓋上蓋破片封片，在高倍顯微鏡下觀察組織染色情況并照相。對照組為PBS緩沖液代替一抗。

1.5 結(jié)果判定

JAM-1表達(dá)陽性顆粒為棕黃色或黃褐色，表達(dá)部位為細(xì)胞膜或細(xì)胞漿。在400倍顯微鏡下觀察根據(jù)染色深淺及陽性細(xì)胞百分率綜合評價評分：基本不著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分；選取一個高倍鏡視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞率，陽性率<10%計0分，10%～40%計1分，40%～70%計2分，≥70%計3分。以上兩評分相加，總分0～1分為陰性（-），2分為弱陽性（+），3～4分為中等陽性（++），5～6分為強陽性（+++）。綜合陽性率以+～+++作為陽性計算。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，率的比較用x2檢驗或四格表的Fisher確切概率法，檢驗水準(zhǔn)是α=0.05，P<0.05時有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示JAM-1主要表達(dá)在子宮內(nèi)膜癌組織中增生的腺上皮細(xì)胞、癌細(xì)胞的胞膜上和（或）胞漿中。當(dāng)腫瘤局限于子宮內(nèi)膜時，JAM-1陽性率為 83.33%；JAM-1 在淺層浸潤子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)陽性率為 60.52%，與無肌層浸潤組比較，其陽性率顯著降低（P<0.05），并且隨著子宮內(nèi)膜癌肌層浸潤程度的增高，其表達(dá)顯著降低，統(tǒng)計學(xué)分析顯示，無肌層浸潤、淺肌層浸潤分別與深肌層浸潤比較，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。見表1，圖 1。

圖1 JAM-1蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)（免疫組化染色，×400：JAM-1陽性表達(dá)主要定位于癌細(xì)胞、腺細(xì)胞的胞膜、胞漿中，在無浸潤組織中癌細(xì)胞異型性輕，JAM-1強陽性表達(dá)；淺層浸潤組癌細(xì)胞異性型較強，JAM-1呈陽性表達(dá)；深層浸潤組癌細(xì)胞異型性明顯，核大、不規(guī)則，JAM-1弱陽性表達(dá)）

3 討論

緊密連接在維持正常上皮、內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用，是各種良惡性腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲的屏障結(jié)構(gòu)，緊密連接結(jié)構(gòu)的紊亂對癌細(xì)胞的營養(yǎng)、增殖、遷移、浸潤等方面造成一定的影響[4]。緊密連接是由occludin、claudins、JAMS、zos等蛋白構(gòu)成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)[5]。JAMS是細(xì)胞間緊密連接黏附分子，屬于免疫球蛋白超家族類，包含JAM-1、JAM-2、JAM-3三個成員。JAM-1是新近發(fā)現(xiàn)的跨膜蛋白，已有研究證實JAM-1最先出現(xiàn)在細(xì)胞間接觸位點并能召集其他緊密連接蛋白從而啟動緊密連接的形成[6-8]，這種特性賦予其能夠介導(dǎo)同型細(xì)胞間的黏附[9]。endprint

腫瘤浸潤、侵襲過程非常復(fù)雜：首先，腫瘤細(xì)胞從原發(fā)病灶脫落后黏附到細(xì)胞外基質(zhì)上，基質(zhì)被降解后腫瘤開始浸潤、侵襲。癌細(xì)胞之間的黏附分子丟失后將啟動腫瘤的浸潤、侵襲，這是腫瘤浸潤的首要步驟。當(dāng)細(xì)胞間連接被破壞時，細(xì)胞間的黏附就會松散，致使癌細(xì)胞脫離癌巢，為癌細(xì)胞的游走、轉(zhuǎn)移提供了先決條件。研究認(rèn)為緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞是導(dǎo)致癌癥早期侵襲能力增強和細(xì)胞間粘附能力減弱，增強了腫瘤細(xì)胞的遷移、擴散能力的重要原因[10]。

腫瘤組織侵襲、浸潤的過程中癌細(xì)胞發(fā)生遷移是必不可少的條件。JAM-1因其能影響細(xì)胞的遷移而廣泛的應(yīng)用于腫瘤侵襲、浸潤機制的研究[11-12]。有學(xué)者[13-14]在研究肺的鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌時發(fā)現(xiàn)，與正常肺上皮、乳腺組織相比肺的鱗狀上皮細(xì)胞癌、乳腺癌等癌細(xì)胞JAM-1表達(dá)明顯降低，JAM-1的表達(dá)與癌組織的侵襲程度呈負(fù)相關(guān)，說明JAM-1表達(dá)的下調(diào)能夠促進肺癌、乳腺癌的侵襲。我們猜想JAM-1在子宮內(nèi)膜癌的進展中是否有同樣的變化，是否促進癌細(xì)胞的浸潤。

我們通過免疫組化方法研究JAM-1在不同肌層浸潤深度的子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)腫瘤局限于子宮內(nèi)膜時JAM-1在癌細(xì)胞、腺細(xì)胞的胞膜、胞漿高表達(dá)，特別是細(xì)胞連接處。當(dāng)腫瘤浸潤到肌層時，JAM-1表達(dá)減弱，特別是浸潤到深肌層時偶爾才見到JAM-1陽性顆粒。根據(jù)染色深淺及陽性細(xì)胞率綜合評價利用x2檢驗進行統(tǒng)計分析，得出三組JAM-1的表達(dá)具有統(tǒng)計學(xué)差異。本研究與Naik[14]、趙晶等[15]關(guān)于乳腺癌及宮頸癌的研究結(jié)果較一致，子宮內(nèi)膜癌癌細(xì)胞的JAM-1表達(dá)隨著癌細(xì)胞侵襲肌層越深，表達(dá)逐漸減弱，提示JAM-1與子宮內(nèi)膜癌癌細(xì)胞的侵襲能力呈負(fù)相關(guān)，推測JAM-1的表達(dá)下調(diào)有可能促進子宮內(nèi)膜癌癌細(xì)胞的侵襲。大量研究發(fā)現(xiàn)JAM-1在保持上皮、內(nèi)皮間緊密連接結(jié)構(gòu)的完整發(fā)揮一定的作用，Gumbiner等[16]認(rèn)為細(xì)胞之間緊密連接結(jié)構(gòu)的不完整是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲的主要因素之一。Gutwein等[17]通過siRNA技術(shù)干擾JAM-1的表達(dá)，表達(dá)量顯著降低，誘導(dǎo)腎細(xì)胞癌發(fā)生轉(zhuǎn)移，同時推斷JAM-1的表達(dá)下調(diào)先于腎細(xì)胞癌的侵襲、轉(zhuǎn)移。以上這些研究和本研究從不同角度一致說明了黏附分子JAM-A是構(gòu)成細(xì)胞間緊密連接的重要成分，下調(diào)JAM-A的表達(dá)，影響緊密連接結(jié)構(gòu)的形成，屏障能力減弱，通透性提高，增加了癌細(xì)胞的侵襲能力。本文觀察到子宮內(nèi)膜癌癌細(xì)胞肌層侵襲越深JAM-A的表達(dá)就越弱，猜想JAM-1在子宮內(nèi)膜癌侵襲過程中發(fā)揮一定的作用。

有趣的是在研究JAM-1與不同組織來源的腫瘤侵襲之間的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，上調(diào)JAM-1的表達(dá)可以促進某些腫瘤的侵襲、浸潤。如研究胰島細(xì)胞腫瘤時觀察到JAM-1缺陷型小鼠的癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力下降幅度顯著[18]。McSherry[19]在研究乳腺癌時得出與Naik相反的觀點，前者在長期跟蹤隨訪兩個乳腺癌浸潤癌過程中觀察乳腺癌存活率較高的患者中JAM-1表達(dá)較低，推斷JAM-1表達(dá)上調(diào)可以促進癌變組織周圍血管、淋巴管的生成，為癌細(xì)胞的血性轉(zhuǎn)移、淋巴轉(zhuǎn)移提供條件。目前關(guān)于JAM-1高表達(dá)促進腫瘤進展分子機制研究多數(shù)認(rèn)為JAM-1通過調(diào)節(jié)GTP Rap1酶的活性增強β1-integrin的表達(dá)能力，進而引起上皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞極性消失和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)紊亂[20-21]。然而JAM-1低表達(dá)如何促進腫瘤的浸潤、侵襲的分子機制研究尚少，本實驗發(fā)現(xiàn)JAM-1的表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌肌層浸潤深度成反比，為以后研究JAM-1表達(dá)下調(diào)怎樣促進腫瘤的進展奠定基礎(chǔ)。同時本文只研究了JAM-1與肌層浸潤深度的關(guān)系，下一步會研究JAM-1與不同病理類型、分化程度以及雌激素之間的關(guān)系。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 樂杰，謝幸.婦產(chǎn)科學(xué)[M].第7版，北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：272.

[2] Leslie VP.JAM-1 regulation of endothelial cell migration：Implications for angiogenesis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003，23：2119.

[3] 劉艷翠.小鼠胃癌組織JAM-1的表達(dá)與癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J].牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，33（1）：33-35.

[4] Matter K，Balda MS.Functional of tight junction[J].Methods，2003，30：228-234.

[5] Carola F?rster.Tight junctions and the modulation of barrier function in disease[J].Histochem Cell Biol，2008，130：55-70.

[6] Itoh M，Sasaki H，F(xiàn)uruse M，et al.Junctional adhesion molecule（JAM） binds to PAR-3： a possible mechanism for the recruitment of PAR-3 to tight junctions[J].J Cell Biol，2001，154：491-497.

[7] Mandell KJ，Parkos CA.The JAM family of proteins[J].Adv Drug Deliv Rev，2005，57：857-867.

[8] Hamasaki Y，Itoh M，Sasaki H，et al.Multi-PDZ domain protein 1（MUPP1） is concentrated at tight junctions through its possible interaction with claudin-1 and junctional adhesion molecule[J].J Biol Chem，2002，277：455-461.endprint

[9] Bazzoni G，Martinez-Estrada OM，Mueller F，et al.Homophilic interaction of junctional adhesion molecule[J].J Bid Chem，2000，275：30970-30976.

[10] Ehler E，Horowits R，Zuppinger C，et al.Alterations at the intercalated disk associated with the absence of muscle LIM Protein[J].J Cell Biol，2001，153：763-772.

[11] Zuo H，Gandhi M，Edreira MM，et al.Downregulation of Rap1GAP through epigenetic silencing and loss of heterozygosity promotes invasion and progression of thyroid tumors[J].Cancer Res，2010，70（4）：1389-1397.

[12] Murakami M，Giampietro C，Giannotta M，et al.Abrogation of junctional adhesion molecule-A expression induces cell apoptosis and reduces breast cancer progression[J].PLoS One，2011，6（6）：e21-24.

[13] Paschoud S，Bongiovanni M，Pache JC，et al.Claudin-1 and Claudin-5 expression patterns differentiate lung squamous cell carcinomas from adenocarcinomas[J].Modern Pathology，2007，20（9）：947-954.

[14] Naik MU，Naik TU，Suckow AT，et al.Attenuation of junctional adhesion molecule-A is a contributing factor for breast cancer cell invasion[J].Cancer Res，2008，68（7）：2194-2203.

[15] 趙晶.粘附分子JAM-A與人宮頸癌的侵襲性[J].解剖科學(xué)進展，2010，16（3）：210-213.

[16] Gumbiner BM.Regulation of cadherin adhesive activity[J].J Cell Biol，2000，148（3）：399-404.

[17] Gutwein P，Schramme A，Voss B，et al.Downregulation of junctional adhesion molecule-A is involved in the progression of clear cell renal cell carcinoma[J].Biochemical and Biophysical Research，2009，380（2）：387-391.

[18] Murakami M，F(xiàn)rancavilla C，Torselli I，et al.Inactivation of junctional adhesion molecule-A enhances antitumoral immune response by promoting dendritic cell and T lymphocyte infiltration[J].Cancer Res，2010，70（5）：1759-1765.

[19] McSherry EA，McGee SF，Jirstrom K，et al.JAM-A expression positively correlates with poor prognosis in breast cancer patients[J].Int J Cancer，2009，125（6）：1343-1351.

[20] Nava P，Capaldo CT，Koch S，et al.JAM-A regulates epithelial proliferation through Akt/β-catenin signalling[J].EMBO Rep，2011，12（4）：314-320.

[21] Severson EA，Parkos C.Structural determinants of junctional adhesion molecule A（JAM-A） function and mechanisms of intracellular signaling[J].Curr Opin Cell Biol，2009，21（5）：701-707.

（收稿日期：2014-01-20）endprint

[9] Bazzoni G，Martinez-Estrada OM，Mueller F，et al.Homophilic interaction of junctional adhesion molecule[J].J Bid Chem，2000，275：30970-30976.

[10] Ehler E，Horowits R，Zuppinger C，et al.Alterations at the intercalated disk associated with the absence of muscle LIM Protein[J].J Cell Biol，2001，153：763-772.

[11] Zuo H，Gandhi M，Edreira MM，et al.Downregulation of Rap1GAP through epigenetic silencing and loss of heterozygosity promotes invasion and progression of thyroid tumors[J].Cancer Res，2010，70（4）：1389-1397.

[12] Murakami M，Giampietro C，Giannotta M，et al.Abrogation of junctional adhesion molecule-A expression induces cell apoptosis and reduces breast cancer progression[J].PLoS One，2011，6（6）：e21-24.

[13] Paschoud S，Bongiovanni M，Pache JC，et al.Claudin-1 and Claudin-5 expression patterns differentiate lung squamous cell carcinomas from adenocarcinomas[J].Modern Pathology，2007，20（9）：947-954.

[14] Naik MU，Naik TU，Suckow AT，et al.Attenuation of junctional adhesion molecule-A is a contributing factor for breast cancer cell invasion[J].Cancer Res，2008，68（7）：2194-2203.

[15] 趙晶.粘附分子JAM-A與人宮頸癌的侵襲性[J].解剖科學(xué)進展，2010，16（3）：210-213.

[16] Gumbiner BM.Regulation of cadherin adhesive activity[J].J Cell Biol，2000，148（3）：399-404.

[17] Gutwein P，Schramme A，Voss B，et al.Downregulation of junctional adhesion molecule-A is involved in the progression of clear cell renal cell carcinoma[J].Biochemical and Biophysical Research，2009，380（2）：387-391.

[18] Murakami M，F(xiàn)rancavilla C，Torselli I，et al.Inactivation of junctional adhesion molecule-A enhances antitumoral immune response by promoting dendritic cell and T lymphocyte infiltration[J].Cancer Res，2010，70（5）：1759-1765.

[19] McSherry EA，McGee SF，Jirstrom K，et al.JAM-A expression positively correlates with poor prognosis in breast cancer patients[J].Int J Cancer，2009，125（6）：1343-1351.

[20] Nava P，Capaldo CT，Koch S，et al.JAM-A regulates epithelial proliferation through Akt/β-catenin signalling[J].EMBO Rep，2011，12（4）：314-320.

[21] Severson EA，Parkos C.Structural determinants of junctional adhesion molecule A（JAM-A） function and mechanisms of intracellular signaling[J].Curr Opin Cell Biol，2009，21（5）：701-707.

（收稿日期：2014-01-20）endprint

[9] Bazzoni G，Martinez-Estrada OM，Mueller F，et al.Homophilic interaction of junctional adhesion molecule[J].J Bid Chem，2000，275：30970-30976.

[10] Ehler E，Horowits R，Zuppinger C，et al.Alterations at the intercalated disk associated with the absence of muscle LIM Protein[J].J Cell Biol，2001，153：763-772.

[11] Zuo H，Gandhi M，Edreira MM，et al.Downregulation of Rap1GAP through epigenetic silencing and loss of heterozygosity promotes invasion and progression of thyroid tumors[J].Cancer Res，2010，70（4）：1389-1397.

[12] Murakami M，Giampietro C，Giannotta M，et al.Abrogation of junctional adhesion molecule-A expression induces cell apoptosis and reduces breast cancer progression[J].PLoS One，2011，6（6）：e21-24.

[13] Paschoud S，Bongiovanni M，Pache JC，et al.Claudin-1 and Claudin-5 expression patterns differentiate lung squamous cell carcinomas from adenocarcinomas[J].Modern Pathology，2007，20（9）：947-954.

[14] Naik MU，Naik TU，Suckow AT，et al.Attenuation of junctional adhesion molecule-A is a contributing factor for breast cancer cell invasion[J].Cancer Res，2008，68（7）：2194-2203.

[15] 趙晶.粘附分子JAM-A與人宮頸癌的侵襲性[J].解剖科學(xué)進展，2010，16（3）：210-213.

[16] Gumbiner BM.Regulation of cadherin adhesive activity[J].J Cell Biol，2000，148（3）：399-404.

[17] Gutwein P，Schramme A，Voss B，et al.Downregulation of junctional adhesion molecule-A is involved in the progression of clear cell renal cell carcinoma[J].Biochemical and Biophysical Research，2009，380（2）：387-391.

[18] Murakami M，F(xiàn)rancavilla C，Torselli I，et al.Inactivation of junctional adhesion molecule-A enhances antitumoral immune response by promoting dendritic cell and T lymphocyte infiltration[J].Cancer Res，2010，70（5）：1759-1765.

[19] McSherry EA，McGee SF，Jirstrom K，et al.JAM-A expression positively correlates with poor prognosis in breast cancer patients[J].Int J Cancer，2009，125（6）：1343-1351.

[20] Nava P，Capaldo CT，Koch S，et al.JAM-A regulates epithelial proliferation through Akt/β-catenin signalling[J].EMBO Rep，2011，12（4）：314-320.

[21] Severson EA，Parkos C.Structural determinants of junctional adhesion molecule A（JAM-A） function and mechanisms of intracellular signaling[J].Curr Opin Cell Biol，2009，21（5）：701-707.

（收稿日期：2014-01-20）endprint