鄧呈遜等

摘 要：本研究從銅陵新橋礦區(qū)的高硫礦堆廢水中分離一株嗜酸菌S t1，經(jīng)生理生化特征及16S rDNA分子鑒定，確定其為嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌。該菌株分別在含有FeSO4·7H2O、S0、黃鐵礦石顆粒（FeS2）的9K無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中獲得生長所需要的能量。結(jié)果嗜酸菌S t1對Fe2+氧化速率最快，培養(yǎng)到36h時溶液中44.1g·L-1 FeSO4·7H2O有95%被氧化；S0為能量底物的培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)到26d時培養(yǎng)液中SO42-濃度達(dá)到2.241 2 mg·mL-1，pH值降至1.18；黃鐵礦石顆粒（FeS2）為能量底物的培養(yǎng)體系中，SO42-平均生成速率為1.360 2 mmol·L-1·d-1，黃鐵礦石顆粒氧化速率達(dá)到0.068mmol·d-1·g-1。

關(guān)鍵詞：嗜酸氧化亞鐵硫桿菌；分離；氧化活性

中圖分類號 X172 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）11-27-04

Abstract：A strain of Acidithiobacillus ferrooxidans was isolated from the acid mine drainage of Xinqiao Coal Mine， Tongling county. Strain S t1 was identified as Acidithiobacillus ferrooxidans by morphological and phylogenetic analysis of its 16S rDNA gene sequence. Its oxidation activity with ferrous ion（Fe2+）、elemental sulfur（S0） and pyrite （FeS2）as substrates in 9K medium was studied. When the A.f strain was cultured in 9K mediun with 44.1g·L-1 FeSO4·7H2O as the substrates， 95%of the FeSO4·7H2O was oxidized in 36h. When the A.f strain was cultured in 9K mediun with S0 as the substrates， 2.241 2 mg·mL-1 SO42- concentration， pH value 1.18 was observed in 26d. When the A.f strain was cultured in 9K mediun with FeS2 as the substrates， the average rate of SO42- product was 1.360 2mmol·L-1·d-1，The rate of oxidation of FeS2 was 0.068 mmol·d-1·g-1.

Key words：Acidithiobacillus ferrooxidans；Isolation；Oxidation activity

嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillus ferrooxidans，A.f）等礦山酸性廢水微生物通過對硫化物礦物的生物氧化作用，加速了酸性礦排水（Acid Mine Drainage，AMD）的形成及重金屬元素等有害物質(zhì)的釋放，對礦山周邊土壤和水體等生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的酸性水與重金屬污染[1-3]。因此，研究礦山環(huán)境微生物對其所處環(huán)境介質(zhì)的氧化作用，對礦山AMD環(huán)境防治等有著重要的意義[4]。自Colmer等[5]1947年首次從礦山酸性廢水中分離得到1株A.f以來，對這一類群微生物的篩選及應(yīng)用成為環(huán)境領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。由于該類微生物存在生物多樣性，對生物脫硫、生物浸礦、重金屬脫除等不同的應(yīng)用領(lǐng)域需使用相應(yīng)生物學(xué)特征的菌株，因此分離、收集特定地域環(huán)境中的高效微生物，對加強(qiáng)相關(guān)應(yīng)用領(lǐng)域的研究顯得非常重要。在A.f菌的應(yīng)用過程中，硫、亞鐵離子的生物氧化被認(rèn)為是非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)[6]。鑒于此，本研究從銅陵新橋礦區(qū)的高硫礦堆廢水中分離、純化得到一株嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌，命名為嗜酸菌S tl，研究了該菌株的形態(tài)特征及16S rDNA序列分析，確定其系統(tǒng)分類地位，并考察該菌株在不同底物能源物質(zhì)中的氧化活性，以期為利用該菌株進(jìn)行煤炭生物脫硫應(yīng)用研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 用于嗜酸微生物培養(yǎng)、分離與純化的的酸性水樣品采自銅陵新橋礦區(qū)的高硫礦堆廢水，pH為2.5。黃鐵礦（FeS2）：采自銅陵硫鐵礦固廢堆，電感耦合等離子體–質(zhì)譜法（ICP-MS）檢測其主要成分為黃鐵礦。將采集的黃鐵礦樣品粉碎過篩，取80～120目黃鐵礦顆粒置于干燥器中備用。

1.2 嗜酸菌的的分離純化 取適量酸性廢水10mL接種到100mL 9K液體培養(yǎng)基中，在溫度28℃，轉(zhuǎn)速180r/min的搖床中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，按照同樣的方法將培養(yǎng)的菌液再轉(zhuǎn)接富集2次得富集菌液。取富集培養(yǎng)的菌液1mL加入90mL滅菌9K液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基顏色由澄清變?yōu)榧t棕色，瓶底出現(xiàn)較多黃色沉淀時，取1mL富集菌液進(jìn)行梯度稀釋，每個梯度的稀釋液均勻涂布在固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)10d左右。挑取單菌落進(jìn)行多次劃線分離、液體富集培養(yǎng)，分離出純A.f菌株。挑取單菌斑進(jìn)行革蘭氏染色法和鏡檢觀察。

1.3 嗜酸菌株的16S rDNA鑒定

1.3.1 菌體總DNA的提取 取200mL菌液，1 000r低速離心10min去雜質(zhì)→10 000r高速離心20min收集菌體→1∶1稀硫酸（pH =2）洗滌3次，離心收集菌體→上海生工Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取。

1.3.2 16S rDNA擴(kuò)增及序列分析 50μLPCR反應(yīng)體系：模版DNA（50ng/μL）2uL、10μM引物1（27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）4μL、10μM引物2（1492R：5-TACGGYYTACC TTGTTACGACTT-3）4μL、10×PCR 緩沖液5μL、2.5mM Mg2+ 3μL、10mM dNTP 2μL、5u/μLTaq DNA聚合酶2uL、無菌H2O 28μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min→95℃解鏈30s→55℃退火30s→72℃延伸1min，循環(huán)35次，延伸10min。1.5%瓊脂糖凝膠檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果提交GenBank進(jìn)行blast比對，鑒定菌株種屬。

1.4 A.f菌對Fe2+、單質(zhì)硫、黃鐵礦顆粒（FeS2）的氧化活性 取無機(jī)鹽培養(yǎng)液80mL于250mL三角瓶中，接入菌液20mL，分別以44.1g·L-1FeSO4·7H2O、10g·L-1單質(zhì)硫粉、1g80～120目的黃鐵礦（FeS2）顆粒為底物，調(diào)節(jié)起始pH值到2.5，28℃、轉(zhuǎn)速180r/min振蕩培養(yǎng)，定期取培養(yǎng)上清液測pH值：玻璃電極法（GB 6920-1986）[7]；Fe2+濃度：鄰菲羅啉分光光度法[8]；SO42-濃度：硫酸鋇比濁法[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)特征及16SrDNA鑒定 分離得到的菌株在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)10d左右，平板上出現(xiàn)邊緣整齊、表面干燥的圓形單菌落。在培養(yǎng)初期菌落呈白色，后期呈黃褐色。菌落直徑在1.5mm左右，中部突起、質(zhì)地較硬。顯微鏡下呈桿狀或鏈桿狀，為革蘭氏陰性菌。圖1顯示：篩選到的菌株與與嗜酸氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillus ferrooxidans，A.f）親緣關(guān)系較近，16S rDNA序列相似性達(dá)到98%以上。綜上，經(jīng)形態(tài)學(xué)及16S rDNA分子鑒定，可判斷其為嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌，命名為S tl。

2.2 嗜酸菌S tl對Fe2+的氧化活性 在9K液體培養(yǎng)基中，嗜酸菌S tl以FeSO4·7H2O為能源底物，氧化Fe2+成Fe3+。嗜酸菌S tl在9K液體培養(yǎng)基中的一個氧化反應(yīng)周期內(nèi)，培養(yǎng)液顏色最初為淺乳黃色，2d左右顏色變深，呈橘色，3～4d左右出現(xiàn)黃色沉淀物，顏色繼續(xù)變深，7d左右大量黃色沉淀物附著在瓶底和瓶壁，培養(yǎng)液顏色變?yōu)殍F銹色。

由圖2可知，嗜酸菌S tl以FeSO4·7H2O為能源的培養(yǎng)體系中，前12hFe2+氧化率小于10%，12h后Fe2+氧化速率迅速增加，36h后Fe2+氧化速率達(dá)95%。岳興玲等人研究一株源于煤矸石的氧化亞鐵硫桿菌對Fe2+的氧化速率可達(dá)93%，其氧化活性略低于本研究中的嗜酸菌S tl。圖3中，培養(yǎng)液pH值不斷持續(xù)下降，0～12h內(nèi)培養(yǎng)液pH值從2.5降到1.9，之后隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸緩慢下降，48h后pH值降至1.7左右。嗜酸菌S tl通過自身代謝將Fe2+轉(zhuǎn)化為Fe3+，F(xiàn)e3+濃度逐漸增高，F(xiàn)e3+水解、與溶液中離子結(jié)合產(chǎn)生絡(luò)合物過程中會產(chǎn)生大量H+，故培養(yǎng)體系中pH值不斷下降，這一結(jié)果與劉玉嬌等人的研究結(jié)果相一致。

2.3 嗜酸菌S tl對單質(zhì)硫的氧化活性 在有氧條件下，嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌以元素硫?yàn)槟茉?，S0被氧化為SO42-，使培養(yǎng)液中SO42-濃度增加，pH降低，以此獲得生命活動的所需能量。其離子方程式為：S+H2O+1.5O2→2H++SO42-。故可用氧化體系中SO42-濃度、pH值的變化趨勢來反映嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌對S0的氧化活性。

由圖4可知，在培養(yǎng)的前3dSO42-生成速率很低，6d后SO42-濃度開始不斷大幅增高，19d時達(dá)2.162 2mg·mL-1，反應(yīng)至26d結(jié)束實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)液中SO42-濃度達(dá)到2.241 2mg·mL-1。由表5可知，培養(yǎng)液pH值一直呈下降趨勢，前3dpH值下降較緩慢，從第3天開始才有較大幅度下降，19d后pH值下降開始變緩，26d反應(yīng)結(jié)束時pH值降至1.18。培養(yǎng)液顏色出現(xiàn)從澄清透明、淡黃色、顏色加深至培養(yǎng)液渾濁的變化。3d以前培養(yǎng)液基本澄清透明，S0顆粒粘連在器壁上或漂浮在培養(yǎng)基液體表面。培養(yǎng)至第6天始，漂浮在培養(yǎng)基液體表面的S0粉顆粒逐漸減少、溶解，培養(yǎng)液呈均一的淡黃色，隨著培養(yǎng)時間的延后，培養(yǎng)液顏色逐漸加深。

綜上，嗜酸菌S tl對S0的氧化效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對Fe2+的氧化效率。以上現(xiàn)象表明嗜酸菌S tl在接種初期有一段延滯期，菌體數(shù)及氧化活性不高，需要調(diào)節(jié)自身生理機(jī)制來適應(yīng)生長環(huán)境，可見嗜酸菌S tl對固體S0粉顆粒的利用比對Fe2+的利用情況更復(fù)雜。單質(zhì)硫本身的理化特征也影響了嗜酸菌S tl對S0的氧化效率。單質(zhì)硫粉疏水強(qiáng)，不易溶于水。有研究表明當(dāng)嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌以單質(zhì)硫?yàn)榈孜锷L時，涉及到菌對S0粉固體顆粒表面吸附，菌體表達(dá)的表面活性物質(zhì)透過細(xì)菌壁擴(kuò)散，促進(jìn)細(xì)菌與硫的接觸等一系列復(fù)雜的傳質(zhì)過程[12]。由于嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌的疏水性，在單質(zhì)硫顆粒表面吸附慢，使得菌體對S0粉的吸附傳質(zhì)步驟成為嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌對單質(zhì)S氧化過程中的限速步驟[13]。隨著細(xì)菌對新環(huán)境的適應(yīng)、氧化硫相關(guān)酶系統(tǒng)的啟動，延滯期過去，嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌開始以S0為能量底物進(jìn)行生長繁殖。

3 結(jié)論

（1）從銅陵新橋礦區(qū)的高硫礦堆廢水中分離、純化得到一株嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌，菌落呈圓形，直徑1.5mm左右，黃褐色、質(zhì)地較硬、中部突起。顯微鏡下呈桿狀或鏈桿狀，革蘭氏陰性菌。

（2）分離純化得到的嗜酸菌S tl可以利用Fe2+、S0、FeS2獲得能量生長，對Fe2+的氧化速率最快。

（3）28℃，180/min，初始pH值為2.5的培養(yǎng)條件下，嗜酸菌S tl以Fe2+為能量底物時，培養(yǎng)到36h時95%FeSO4·7H2O被氧化；S0為能量底物時，培養(yǎng)到26d時培養(yǎng)液中SO42-濃度達(dá)到2.241 2mg·mL-1，pH值降至1.18；黃鐵礦石（FeS2）為能量底物時，SO42-平均生成速率為1.360 2mmol·L-1·d-1，黃鐵礦氧化速率達(dá)到0.068mmol·d-1·g-1。

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（責(zé)編：張宏民）

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