鄒秀蘭 王觀峰 皮榮標 李文立 俞永珍 鄒玉平

Bax、Bcl-2在丙烯醛誘導的ARPE-19細胞凋亡中的作用△

鄒秀蘭 王觀峰 皮榮標 李文立 俞永珍 鄒玉平

丙烯醛；ARPE-19細胞；細胞凋亡；Bax；Bcl-2；

目的觀察Bax、Bcl-2蛋白在丙烯醛誘導的體外培養(yǎng)ARPE-19細胞凋亡中的作用。方法將培養(yǎng)的ARPE-19細胞置于含有體積分數(shù)10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基中，于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育；用不同濃度(50 μmol·L-1、100 μmol·L-1)丙烯醛處理對數(shù)期培養(yǎng)的ARPE-19細胞24 h，設不加藥的空白對照組，用流式細胞儀檢測丙烯醛誘導ARPE-19細胞的凋亡情況，Western blot檢測ARPE-19細胞中Bax、Bcl-2蛋白的表達情況。結果流式細胞儀顯示，早期在空白對照組中細胞凋亡率為2.97%，50 μmol·L-1丙烯醛處理組中為4.67%，100 μmol·L-1丙烯醛處理組中為50.07%；晚期凋亡細胞在空白對照組中細胞凋亡率為1.66%，50 μmol·L-1丙烯醛處理組中為24.24%，100 μmol·L-1丙烯醛處理組中為6.77%。Western blot顯示空白對照組的Bax/Bcl-2蛋白表達的比值為0.293 9，50 μmol·L-1丙烯醛處理組的Bax/Bcl-2蛋白表達的比值為1.389 2，100 μmol·L-1丙烯醛處理組的Bax/Bcl-2蛋白表達的比值為1.496 1。結論丙烯醛可以通過激活凋亡蛋白Bax及抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達來導致ARPE-19細胞凋亡。

[眼科新進展，2014，34(7):633-636]

我們和其他研究人員前期研究發(fā)現(xiàn)，丙烯醛可以導致人視網(wǎng)膜色素上皮(human retinal pigment epithelial-19，ARPE-19)細胞數(shù)量明顯減少、腫脹、壞死或染色體聚集、胞漿收縮、胞膜出芽等，目前的研究尚不能證明是何種路徑介導這一損傷過程[1-7]。近期國內外研究發(fā)現(xiàn)丙烯醛可以激活大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、活性氧自由基，促進氧自由基反應干擾細胞內的氧化磷酸化過程，損傷生物膜系統(tǒng)、氨基酸、DNA、RNA等；氧自由基反應作為信號分子參與了凋亡基因的表達與凋亡蛋白的激活[8-12]。本研究在前期研究的基礎上，擬通過丙烯醛誘導ARPE-19細胞的凋亡模型，初步探討B(tài)ax、Bcl-2蛋白在該細胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1材料與儀器ARPE-19細胞株、丙烯醛由中山大學藥學院提供；胰蛋白酶購自美國Sigma公司，改良Eagle培養(yǎng)基DMEM和胎牛血清購自美國Gibco公司；ECL化學發(fā)光試劑盒購自美國PIERCE公司，丙烯酰胺(Acrylamide)購自美國B.M.公司；四甲基乙二胺購自美國B.M.公司，POVEF膜購自美國BIO-RAD公司；X光片購自日本KODAK公司；其他儀器包括倒置相差顯微鏡(Leica，德國)、流式細胞儀(Beckman Coulter，美國)、Eppendorf恒溫振蕩儀(Eppendorf公司，美國)、MiniSpin臺式離心機(Eppendorf公司，美國)、450型全波長多功能酶標儀(Eppendorf公司，美國)、Tanon凝膠成像系統(tǒng)(TANON公司，中國上海)。

1.2實驗方法

1.2.1實驗分組丙烯醛使用前要立即溶解到無血清的DMEM-F12培養(yǎng)液中。待培養(yǎng)板中的單層ARPE-19細胞長滿底部約70%時，用不含血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后(即按血清饑餓法)，將培養(yǎng)細胞分為:空白對照組，不加任何藥物；不同濃度丙烯醛處理組，培養(yǎng)細胞中加入丙烯醛(終濃度為50 μmol·L-1、100 μmol·L-1)處理24 h。

1.2.2流式細胞儀檢測凋亡細胞無菌超凈臺內進行ARPE-19細胞的培養(yǎng)及6孔板的鋪板。將ARPE-19細胞以含體積分數(shù)10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸，調整細胞密度為109L-1，3 mL接種于6孔細胞培養(yǎng)板。第3天吸去原液，每孔再給予3 mL無血清DMEM-F12培養(yǎng)基。第4天每孔吸去原液，每孔再按上述實驗分組給予不同濃度的藥物處理。待藥物丙烯醛作用24 h后，將細胞培養(yǎng)板中各組的培養(yǎng)基分別轉移到位于冰上的15 mL錐形管內，用PBS溶液進行重懸，0.5 mL 2.5 g·L-1Trpsin(不含EDTA)消化細胞；收集各組培養(yǎng)板上的細胞，并用預冷的PBS緩沖液重懸，維持細胞密度在109L-1左右；每組離心管內取0.5 mL細胞重懸液，加入1.25 μL Annexin V-FITC，18～24 ℃室溫避光反應15 min，室溫下1000 r·min-1離心5 min，用0.5 mL預冷緩沖液輕輕重懸細胞，加入10 μL Propidium Iodide；立即將樣品放入冰盒內保存，并送往檢測中心進行檢測。

1.2.3Westernblot檢測Bax、Bcl-2蛋白的表達按照說明書中的程序和方法檢測Bax和Bcl-2蛋白的表達情況。

2 結果

2.1細胞凋亡情況正常細胞在空白對照組中所占比例94.80%，50 μmol·L-1丙烯醛處理組中為60.98%，100 μmol·L-1丙烯醛處理組中為42.58%；與正常對照組相比，50 μmol·L-1丙烯醛處理組中的正常細胞數(shù)明顯下降(P=0.000 1)。早期空白對照組中細胞凋亡率為2.97%，50 μmol·L-1丙烯醛處理組中為4.67%，100 μmol·L-1丙烯醛處理組中為50.07%；與空白對照組相比，50 μmol·L-1丙烯醛處理組中的早期凋亡細胞數(shù)明顯上升(P=0.001)。晚期空白對照組中細胞凋亡率為1.66%，50 μmol·L-1丙烯醛處理組中為24.24%，100 μmol·L-1丙烯醛處理組中為6.77%；與空白對照組相比，50 μmol·L-1丙烯醛處理組中的晚期凋亡細胞數(shù)明顯上升(P=0.000 1)?？偟蛲雎试诳瞻讓φ战M中為4.63%，50 μmol·L-1丙烯醛處理組中為28.91%，100 μmol·L-1丙烯醛處理組中為56.84%；與空白對照組相比，50 μmol·L-1丙烯醛處理組中的總凋亡細胞數(shù)明顯上升(P=0.000 1)，見圖1。

Figure 1 Apoptotic cells detected by flow cytometry.A:Blank control group;B:50 μmol·L-1 acrolein group for 24 hours;C:100 μmol·L-1 acrolein group for 24 hours 流式細胞儀檢測凋亡細胞情況。A:空白對照組中ARPE-19凋亡細胞；B：50 μmol·L-1丙烯醛作用24 h后ARPE-19凋亡細胞；C：100 μmol·L-1丙烯醛作用24 h后ARPE-19凋亡細胞

2.2Westernblot檢測ARPE-19細胞Bax、Bcl-2表達情況利用人源性多克隆抗體檢測Bax與Bcl-2蛋白在ARPE-19細胞中的表達情況，結果如圖2所示；空白對照組的Bax/Bcl-2蛋白表達的比值為0.293 9，50 μmol·L-1丙烯醛處理組的Bax/Bcl-2蛋白表達的比值為1.389 2，100 μmol·L-1丙烯醛處理組的Bax/Bcl-2蛋白表達的比值為1.496 1。與空白對照組相比，50 μmol·L-1丙烯醛處理組的Bax/Bcl-2蛋白表達顯著升高。

3 討論

在丙烯醛誘導ARPE-19細胞凋亡的研究中，國外學者就發(fā)現(xiàn)有大量ROS、氧自由基、一氧化氮(nitrogen monoxide，NO)等形成。我們在早期研究中已證實50 μmol·L-1丙烯醛可以導致ARPE-19細胞的大量損傷，其可能與以下因素有關:(1)ROS的增高可以降低細胞內抗氧化劑的量導致細胞凋亡形態(tài)學特征的出現(xiàn)，使用內源性或外源性抗氧化劑可以阻斷細胞的凋亡過程，且細胞內ROS水平與細胞的凋亡水平成正相關。(2)在體內，氧自由基為含有很強活性的化學物質，能夠損傷細胞內的蛋白質、核酸、脂肪等?；A研究表明，氧自由基反應是諸多生命化學反應的一個基本組成部分，同時也作為信號因子作用于凋亡信號通路來介導凋亡蛋白與凋亡基因的表達，從而影響細胞的代謝和細胞內環(huán)境。(3)作為氧自由基之一的NO就是一種神經(jīng)轉導信號因子。一氧化氮合酶(induce nitric oxide synthase，iNOS)的活化在NO誘導缺氧細胞發(fā)生凋亡上起著關鍵作用。在此病理過程中，iNOS的活化促進NO的生成及NO與O2·相互結合生成ONOO-。據(jù)此有學者認為NO和ONOO-可能是觸發(fā)細胞凋亡的關鍵因子。(4)許多可以誘導細胞凋亡的其他理化因素同樣也可以導致氧化應激的產(chǎn)生，如金屬化合物、電離輻射和紫外線等[13-16]。

Figure 2 Expression of Bax and Bcl-2 protein detected by Western blot in each group Western blot檢測各組Bax、Bcl-2蛋白表達情況

在后續(xù)實驗中，我們發(fā)現(xiàn)隨著丙烯醛濃度的升高，ARPE-19細胞的損傷增加，總凋亡細胞數(shù)也隨之增高。我們認為作為真核生物細胞內氧化磷酸化和ATP合成，不僅為細胞提供能量，還參與了細胞分化、信息傳遞和凋亡等多種生命過程，且在調控細胞生長或轉導、擴大細胞凋亡信號過程起到?jīng)Q定作用。作為細胞凋亡的內源性途徑的上游，線粒體與半胱氨酸蛋白水解酶、下游的效應器之間連接。多種理化刺激因子均可以激活此凋亡途徑。國外學者研究均發(fā)現(xiàn)丙烯醛可以介導線粒體跨膜電位的破壞，而后者已被公認是細胞凋亡級聯(lián)反應發(fā)生的先兆之一。線粒體跨膜電位的破壞，也可以被看成是線粒體膜固有特性(如通透性等)的改變，繼而使得線粒體內的多種氧自由基和其他活性物質進入細胞質內，導致“瀑布”樣的凋亡過程[17-19]。我們的研究實驗組50 μmol·L-1丙烯醛即可造成Bax/Bcl-2蛋白表達比值的顯著提高，據(jù)此我們認為丙烯醛可能通過作用于多種理化因子，激活和上調Bcl-2族基因Bax/Bak凋亡蛋白的表達，影響甚至于逆轉線粒體跨膜電位，導致細胞色素C的異常分泌。而后者可以激活細胞質內的凋亡蛋白酶激活因子、脫氧三磷酸腺苷等caspase前體激活物。這些前體激活物可以激活凋亡通路下游的caspases-3及caspases-7，最終使細胞產(chǎn)生凋亡。另外，丙烯醛也可以干擾轉錄因子NF-κB的生成，后者可以調節(jié)如抗凋亡Bcl-2家族、cLAP等抗凋亡基因的表達。我們考慮這種改變可能是由于相關凋亡蛋白的改變介導的線粒體“內源性”細胞凋亡。實驗中我們還發(fā)現(xiàn)隨著丙烯醛濃度提高，Bax/Bcl-2蛋白表達比值也進一步升高，但差異無統(tǒng)計學意義。這可能與50 μmol·L-1丙烯醛已經(jīng)激活了“瀑布”樣的細胞凋亡過程，而100 μmol·L-1丙烯醛在此基礎上又引發(fā)了多種導致細胞死亡或凋亡信號通路有關。本研究目前僅從蛋白水平說明丙烯醛通過Bax/Bcl-2線粒體凋亡途徑導致ARPE-19細胞損傷，為進一步探尋丙烯醛誘導ARPE-19細胞損傷的機理今后擬從基因水平及凋亡信號調節(jié)路徑等進行深入研究。

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date:Feb 27，2014

Guangdong Province Science and Technology Project(No:20120314)From theDepartmentofOphthalmology，GuangzhouGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand(ZOU Xiu-Lan，YU Yong-Zhen，ZOU Yu-Ping)，Guangzhou510010，GuangdongProvince，China；DepartmentofOphthalmology，theThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity(WANG Guan-Feng)，Guangzhou510150，GuangdongProvince，China；DepartmentofPharmacologyandToxicology，SchoolofPharmaceuticalSciences，SunYat-SenUniversity(PI Rong-Biao)，Guangzhou510006，GuangdongProvince，China；DiseasePreventionandControlCenterofGuangdongProvince(LI Wen-Li)，Guangzhou510300，GuangdongProvince，China

Roles of Bax and Bcl-2 in ARPE-19 cell apoptosis induced by acrolein

ZOU Xiu-Lan，WANG Guan-Feng，PI Rong-Biao，LI Wen-Li，YU Yong-Zhen，ZOU Yu-Ping

acrolein;ARPE-19 cell;cell apoptosis;Bax;Bcl-2

ObjectiveTo observe the roles of Bax and Bcl-2 in ARPE-19 cells apoptosis induced by acrolein.MethodsThe ARPE-19 cells were cultured in medium,containing volumn fraction 10% fetal bovine serum,2.48 g·L-1sodium bicarbonate,100 U·mL-1penicillin and 100 μg·mL-1streptomycin,in the 37 ℃ incubator with volumn fraction 5% CO2.The cells were treated with acrolein (0 μmol·L-1,50 μmol·L-1and 100 μmol·L-1) for 24 hours,then the apoptotic cells was detected by flow cytometry,and the expression of Bcl-2 and Bax protein were detected by Western blot.ResultsEarly apoptosis cell rate was 2.97% in blank control group,4.67% in 50 μmol·L-1acrolein group and 50.07% in 100 μmol·L-1acrolein group.Late apoptotic cell rate were 1.66%,24.24%,6.77% in blank control group,50 μmol·L-1acrolein group and 100 μmol·L-1acrolein group,respectively.The ratio expression of Bax/Bcl-2 was 0.293 9,1.389 2,1.496 1 in blank control group,50 μmol·L-1acrolein group and 100 μmol·L-1acrolein group,respectively.ConclusionThe apoptosis of ARPE-19 cells are induced by the up-expression of Bax and down-expression of Bcl-2 activated by acrolein.

鄒秀蘭，女，1967年10月出生，江西人，副主任醫(yī)師兼科副主任。聯(lián)系電話:15323363967;E-mail:xlzou 2003@yahoo.com.cn

作者簡介:王觀峰，男，1988年2月出生，江西人，住院醫(yī)師。聯(lián)系電話:13711090644;E-mail:306841512@qq.com

2014-02-27

廣東省科技計劃項目(編號:20120314)

510010 廣東省廣州市，廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院眼科(鄒秀蘭，俞永珍，鄒玉平)；510150 廣東省廣州市，廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院眼科(王觀峰)；510006 廣東省廣州市，中山大學藥學院藥理學和毒理學研究室(皮榮標)；510300 廣東省廣州市，廣東省疾病預防控制中心(李文立)

鄒玉平，E-mail:xlzou2003@yahoo.com.cn

鄒秀蘭，王觀峰，皮榮標，李文立，俞永珍，鄒玉平．Bax、Bcl?2在丙烯醛誘導的ARPE?19細胞凋亡中的作用[J]．眼科新進展，2014，34(7)：633?636．

10．13389/j．cnki．rao．2014．0173

【實驗研究】

AboutZOUXiu-Lan:Female，born in October，1967.Tel:15323363967;E-mail:xlzou2003@yahoo.com.cn

AboutWANGGuan-Feng:Male，born in February，1988.Tel:13711090644；E-mail:306841512@qq.com

修回日期:2014-04-10

本文編輯:董建軍

Accepteddate:Apr 10，2014

Responsibleauthor:ZOU Yu-Ping，E-mail:xlzou2003@yahoo.com.cn

[RecAdvOphthalmol，2014，34(7):633-636]