何 升，李東明，賴允麗，張 強，闕 婷，唐燕青

南寧市2685例貧血患兒α-地中海貧血基因診斷分析

何 升，李東明，賴允麗，張 強，闕 婷，唐燕青

目的 了解南寧地區(qū)貧血患兒α-地中海貧血(地貧)發(fā)生情況、基因類型及頻率。方法 采用單管多重PCR體系擴增結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳和反向點雜交技術(shù)，對診斷為貧血的患兒2685例進行常見α-地貧基因檢測，對HbA2和HbF升高者再進行β-地貧基因檢測。結(jié)果 2685例患兒中，檢出α-地貧1243例(46.29%)，22種基因類型，主要為--sea/αα(23.76%)，其次為-α3.7/αα(4.69%)，--sea/-α3.7(3.84%)，--sea/αCSα(3.17%)；包括6種等位基因1563個，主要為--sea(56.62%)，其次為-α3.7(15.74%)和αCSα(14.52%)；α復合β地貧檢出率為5.18%。結(jié)論 南寧地區(qū)貧血患兒α-地貧基因突變率、中間型α-地貧及復合β地貧發(fā)生率均較高，應在該類患兒中進行基因診斷，為該類患者的病因診斷和治療提供依據(jù)。

南寧；地中海貧血；基因診斷；兒童；類型

地中海貧血(thalassemia，簡稱地貧)是廣西地區(qū)最常見的血液學遺傳疾病。育齡人群中α-地貧發(fā)生率為13.78%～17.46%[1]，新生兒中發(fā)生率約為7.8%[2]，貧血患兒中發(fā)生率更是高達20.11%[3]。為了解本地區(qū)貧血患兒中α-地貧發(fā)生情況及其基因分布，本研究對2006年1月～2012年8月在我院就診，經(jīng)血液學分析、生化檢查確診為貧血的患兒2685例進行α-地貧基因診斷，現(xiàn)報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2006年1月～2012年7月在本院門診進行健康體檢、遺傳咨詢及住院患兒2685例，經(jīng)血液學、生化檢查診斷為貧血，其中男1698例，女987例，年齡3 d～14歲。

1.2 方法 空腹取肘靜脈血2 ml置于EDTA-K2抗凝血管中，采用Lab-Aid 820核酸提取儀(廈門致善生物公司)提取全血DNA，利用iCycler PCR儀(美國Biorad公司)對東南亞缺失型α-地貧1雜合子(--sea)、α-地貧2雜合子(-α3.7,-α4.2)缺失型或Hb CS(CD142TAA→CAA)、QS(125CTG→CCG)及WS(CD122CAA→CAG))進行擴增，3種缺失型α-地貧擴增產(chǎn)物在DY-2C電泳儀(北京六一儀器廠)經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)Gel Doc XR凝膠成像分析儀(美國Biorad公司)進行分析；3種突變型α-地貧，經(jīng)100 ℃煮沸變性后，在SHA-B水浴恒溫振蕩器(金壇金南儀器制造公司產(chǎn)品)45 ℃水浴雜交，肉眼讀取結(jié)果。對HbA2>3.5%和HbF>4.0%者，再進行β-珠蛋白基因17種突變：CD41-42(-TCTT)、IVS-2-654(C→T)、CD17(A→T)、-28(A→ G)、CD26(G→A)、CD71-72(+A)、 CD43(G→ T)、-29(A→G)、起始密碼子ATG→AGG、CD14-15(+G)、CD27-28(+C)、-32(C→A)、-30(T→C)、IVS-1-1(G→T)、IVS-1-5(G→C)、CD31(-C)、CAP+40-+43(-AAAC)檢測，試劑盒購于深圳益生堂生物公司，按試劑盒說明書進行操作、質(zhì)量控制及結(jié)果判斷；對部分可疑罕見地貧者，送深圳益生堂生物公司進行基因序列分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，組間率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 α-地貧基因檢出情況 2685例中，檢出α-地貧1243例，檢出率為46.29%。其中Hb H病247例，α-地貧1雜合子638例，α-地貧2雜合子、純合子和雙重雜合子分別為330例、10例和18例。共有22種基因型(表1)。另檢出α-復合β地貧139例。男女性患兒中檢出率分別為45.76%(466/987)和47.21%(777/1698)，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.5308，P>0.05)。

表1 α-地貧基因類型與突變發(fā)生率

2.2 α-地貧基因突變類型及其分布 1243例α-地貧中，共檢出1563個含有6種常見類型α-地貧的等位基因，其攜帶率、頻率和分布情況見表2。缺失型α-地貧占79.85%(1248/1563)，突變型α-地貧占20.15%(315/1563)，其中除αCSα突變型α-地貧構(gòu)成比略低于-α3.7、高于-α4.2外(χ2=39.5238,P<0.01)外，其余兩種等位基因構(gòu)成比均明顯低于缺失型(χ2=312.1245,χ2=38.0215,P<0.01)。

表2 α-地貧基因攜帶率、等位基因突變頻率和構(gòu)成比

2.3 α復合β-地貧檢出情況 1243例α-地貧患者中，同時檢出β-地貧139例，α復合β-地貧檢出率為5.18%。其中以α復合β41-42/βA最高為1.75%，其次β17/βA為1.01%，α復合重型和中間型β地貧率為1.01%(表3)。

3 討論

流行病學資料顯示，α-地貧廣泛分布于地中海沿岸、東南亞及我國南方地區(qū)，其發(fā)生率、基因突變類型和頻率存在明顯的種族、地域及人群差異。本研究對2685例貧血患兒進行α-地貧基因檢測，共檢出α-地貧1243例，檢出率為46.29%明顯高于本地區(qū)新生兒的9.86%[2]，育齡人群的13.781%～17.46%[1]，表明本地區(qū)地貧是導致兒童貧血的主要原因之一[4]。

表3 α復合 β地貧基因類型

注：a：包括α-地貧1雜合子，α-地貧-2純合子和雙重雜合子；b：包括α-地貧2雜合子；c：包括α-地貧1雜合子復合α-地貧2雜合子

在α-地貧攜帶者或患兒中共檢出基因型23種，以缺失型雜合子為主，占67.10%，其中東南亞缺失型占51.33%，-α3.7和-α4.2缺失型分別占10.14%和5.63%，與國內(nèi)人群中構(gòu)成比相似[5-6]。Hb H病患者可表現(xiàn)為輕到重度貧血、黃疸及肝脾腫大等，尤其是少數(shù)Hb H-CS或QS病有較重的貧血似[7]。本研究中突變型α-地貧-2雜合子檢出率為10.78%，其中Hb-CS檢出率為2.72%，Hb H-CS檢出率高達3.17%，占Hb H病的34.41%(85/247)，僅低于-α3.7缺失型Hb H病的3.84%，且多表現(xiàn)為中到重度貧血。表明應加強的Hb-CS檢測，這不但可作為該類Hb H病患兒貧血診斷與治療依據(jù)，也可為其流行病學調(diào)查或干預提供資料。同時，還檢出α-地貧-2純合子和雙重雜合子28例，檢出率1.04%。

本研究中共檢出6種常見類型α-地貧的等位基因1563個，未發(fā)現(xiàn)其他罕見類型的等位基因；仍以缺失型為主，占79.85%(1248/1563)，突變型占20.15%(315/1563)，與國內(nèi)報道相似[3,5]。值得注意的是，雖缺失型基因構(gòu)成比均高于αWSα和αQSα突變基因(P>0.01)，αCSα突變型基因的構(gòu)成比僅明顯地低于東南亞缺失型，與-α3.7缺失型相近(P>0.05)，明顯高于-α4.2缺失型(P<0.01)，這與玉林地區(qū)報道[5]存在一定的差異。導致這種差異可能與本地區(qū)人群中αCSα基因發(fā)生率較高有關(guān)，同時也表明在該地區(qū)進行該基因檢測是非常有必要的。

廣西地區(qū)β-地貧亦有較高的發(fā)生率，人群中同時有α-地貧復合β-地貧的亦不少。研究表明[6]，α復合β-地貧患者血液學表現(xiàn)為β-地貧特點，因此，對HbA2和HbF升高者或已確診的β-地貧者應進行α-地貧基因檢測，以檢出α復合β-地貧。本研究在2685例患兒中，對HbA2和HbF升高者同時進行α和β-地貧基因檢測，共檢出β-地貧139例，檢出率為5.18%。其中以β41-42和β17雜合子檢出率最高，分別為1.75%和1.01%。α復合重型和中間型β-地貧率為1.01%，其中α-地貧-2復合重型和中間型β-地貧占64%；另檢出中間型α-地貧復合β-地貧6例，這與該地區(qū)人群中α復合β-地貧的發(fā)生率較高有關(guān)，提示對夫婦均為復合型地貧者進行雙重產(chǎn)前診斷尤為重要[8]。

廣西地區(qū)貧血患者中α-地貧及其復合β-地貧的發(fā)生率均較高，應加強新生兒地貧篩查，以做到早篩查、早診斷。同時，應加強育齡人群地貧篩查與診斷，掌握流行病學資料，進一步建立并完善高危人群跟蹤體系，對高危夫婦進行產(chǎn)前診斷，才能有效避免中間型及重型地貧患兒的出生，這是降低出生缺陷的有效措施。

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Genetic diagnosis of α-thalassemia in 2685 children with anemia from Nanning City

He Sheng,Li Dongming,Lai Yunli,Zhang Qiang,Que Ting,Tang Yanqing

Central Laboratory of Genetic Metabolism,Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Chuang Autonomous Region,Nanning,Guangxi,530003,China

Objective To investigate the incidence,genotypes,and frequency of α-thalassemia(thal)in children with anemia in Nanning area.Methods The amplification by polymerase chain reaction system combined with agarose electrophoresis and reverse dot blot hybridization technology were used to detect the α-thal genes in 2685 children diagnosed as anemia from Nanning City.At the same time,those with the increase of HbA2 and HbF levels

the detection of β-thal gene.Results Among the 2685 cases,α-thal was detected in 1243 ones(46.29%).There were 22 different genotypes which mainly were --sea/αα(23.76%),and the next were -α3.7/αα(4.69%)，--sea/-α3.7(3.84%)，and --sea/αCSα(3.17%).There were 1563 alleles of six kinds which mainly were --sea(56.62%)followed by -α3.7(15.74%),and αCSα(14.52%).The detection rate of α-composited-β-thal was 5.18%.Conclusion The gene mutation rate and the incidence of α-thal,intermediate type of α-thal,and composited β-thal are very high in children with anemia from Nanning City.Genetic diagnosis should be carried out among those children patients in order to provide basis for the etiological diagnosis and treatment.

Nanning;thalassemia;genetic diagnosis;child;type

530003 南寧，廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院遺傳代謝中心實驗室

何 升，電話：18648914684；E-mail:18648914684@126.com

R 556.71

A

1004-0188(2014)01-0036-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.01.014

2013-01-17)