辛?xí)匀?鞏天祥

【實(shí)驗研究】

缺氧對腦脊液-視神經(jīng)屏障中腦膜上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體膜電位的影響△

辛?xí)匀?鞏天祥

缺氧；腦膜上皮細(xì)胞；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；線粒體膜電位；鈣聯(lián)蛋白；腦脊液-視神經(jīng)屏障

目的 探討腦膜上皮細(xì)胞(meningothelial cells，MECs)參與視神經(jīng)疾病的發(fā)病機(jī)理，研究缺氧對MECs功能變化的影響。方法 將培養(yǎng)的MECs分別在體積分?jǐn)?shù)21%O2(對照組)和體積分?jǐn)?shù)1% O2(缺氧組)環(huán)境下孵育1 d和2 d，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗測定和比較MECs的總抗氧化能力(total anti-oxidative capacity，T-AOC)；采用MitoTracker Red檢測和比較MECs在正常氧和缺氧環(huán)境下作用2 d的線粒體膜電位的變化；通過測定鈣聯(lián)蛋白的熒光染色，以評價MECs暴露于氧化應(yīng)激環(huán)境后對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的影響。結(jié)果 與對照組相比，缺氧組的氧化應(yīng)激能力降低，結(jié)果顯示T-AOC下降。對照組和缺氧組細(xì)胞分別培養(yǎng)1 d后，細(xì)胞中T-AOC分別為(0.012 4+0.001 1)U·L-1和(0.011 9+0.009 0)U·L-1，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.915、P=0.382)。分別培養(yǎng)2 d后，缺氧組細(xì)胞中T-AOC(0.010 7+0.008 3)U·L-1低于對照組(0.012 9+0.008 7)U·L-1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.616、P=0.001)。不同氧環(huán)境作用于細(xì)胞2 d后，采用共焦顯微鏡熒光探針方法分析作用于對照組和缺氧組的MECs線粒體膜電位的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺氧組細(xì)胞熒光強(qiáng)度與對照組相比明顯減低；同時通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，缺氧組MECs鈣聯(lián)蛋白綠色熒光強(qiáng)度較對照組明顯增強(qiáng)。結(jié)論 缺氧通過影響MECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體功能而影響其氧化應(yīng)激能力。

[眼科新進(jìn)展，2014，34(11)：1009-1012]

作為腦脊液-視神經(jīng)屏障的主要細(xì)胞成分，視神經(jīng)腦膜上皮細(xì)胞(meningothelial cells，MECs)直接與視神經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔中的腦脊液相接觸，在保持屏障完整性和維持其正常的生理作用方面發(fā)揮重要作用。在缺氧、高壓力等應(yīng)激下MECs可能發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能變化[1]，從而影響腦脊液-視神經(jīng)屏障的正常生理作用，參與視神經(jīng)疾病的發(fā)病機(jī)制。本研究探討其在視網(wǎng)膜神經(jīng)活動中的作用，為闡明視神經(jīng)疾病的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；丙酮酸鹽、蘋果酸、胰蛋白酶、EDTA、40 g·L-1多聚甲醛、白蛋白、青霉素、鏈霉素(美國Sigma公司)；總抗氧化能力水平ELISA檢測試劑盒(美國MyBioSource公司)；Alexa Fluor 488羊抗鼠IgG、Mitotracker Red(美國Invitrogen公司)；鼠鈣聯(lián)蛋白單克隆抗體(美國BD公司)；75 cm2培養(yǎng)瓶(美國Sarstedt公司)；96孔培養(yǎng)板(美國Costar公司)。

1.2 方法 MECs株生長于75 cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)液為DMEM，含青霉素0.1 U·L-1、鏈霉素0.1 μg·L-1，細(xì)胞融合后，用2.5 g·L-1胰蛋白酶、0.2 g·L-1EDTA溶液消化后，吹打成細(xì)胞懸液，離心機(jī)離心，棄上清液，收集細(xì)胞。

1.2.1 MECs總抗氧化能力水平檢測 將MECs消化后調(diào)整細(xì)胞濃度，以細(xì)胞密度為每瓶1×106細(xì)胞15 mL細(xì)胞懸液接種于75 cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)液為DMEM，含青霉素0.1 U·L-1、鏈霉素0.1 μg·L-1，分別再置于體積分?jǐn)?shù)21%O2(對照組)和體積分?jǐn)?shù)1%O2(缺氧組)環(huán)境下孵育1 d和2 d后，用2.5 g·L-1胰蛋白酶、0.2 g·L-1EDTA溶液消化后，吹打成細(xì)胞懸液，離心機(jī)離心800 r·min-13 min，收集上清液。ELISA 96孔酶標(biāo)板依次編號，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋并加樣，分別設(shè)空白孔、待測樣品孔，所有樣本均設(shè)雙孔檢測。每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL，空白孔除外，溫育后洗滌拍干，加入顯色劑，每孔加終止液100 μL，終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀依序測量450 nm波長各孔的吸光度(OD)值，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度。

1.2.2 MitoTracker Red檢測MECs膜電位 MECs接種于內(nèi)有蓋玻片的兩個腔室培養(yǎng)玻片中(每腔室含30 000細(xì)胞)，培養(yǎng)液為含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、2 mmol·L-1的L-谷氨酰胺和1 mmol·L-1丙酮酸鈉的DMEM，分別置于體積分?jǐn)?shù)21% O2和體積分?jǐn)?shù)1%O2的培養(yǎng)箱中，作用于細(xì)胞2 d后，移出培養(yǎng)液，無血清DMEM 洗1 次，加入預(yù)熱的MitoTracker Red工作液，37 ℃孵育30 min。去除MitoTracker Red染色工作液，用預(yù)溫的PBS 洗滌3次。共聚焦激光顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度并拍照，熒光強(qiáng)度強(qiáng)弱代表膜電位強(qiáng)度高低。

2 結(jié)果

2.1 氧化應(yīng)激對MECs的T-AOC水平影響 培養(yǎng)1 d后，缺氧組與對照組相比，缺氧條件下MECs的T-AOC有所減少，分別為(0.011 9+0.009 0)U·L-1和(0.012 4+0.001 1)U·L-1，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.915、P=0.382)；培養(yǎng)2 d，缺氧組MECs的T-AOC水平(0.010 7+0.008 3)U·L-1與對照組(0.012 9+0.008 7)U·L-1相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.616、P=0.001)。在常氧條件下MECs 培養(yǎng)1 d的T-AOC與2 d相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.908、P=0.385)。暴露于缺氧環(huán)境中2 d的MECs T-AOC水平與同一方法處理1 d的細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-2.289、P=0.045)。

2.2 氧化應(yīng)激對MECs膜電位的影響 本研究采用熒光探針方法分析作用于對照組和缺氧組的MECs線粒體膜電位的變化，作用于細(xì)胞2 d后，用MitoTracker Red檢測線粒體膜電位，激光共聚焦觀察熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度強(qiáng)弱代表膜電位強(qiáng)度高低。結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺氧組細(xì)胞熒光強(qiáng)度與對照組相比明顯減低(圖1)。

2.3 氧化應(yīng)激對MECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的影響 熒光顯微鏡測定MECs暴露于氧化應(yīng)激環(huán)境后對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的影響。結(jié)果顯示，缺氧組缺氧作用MECs 2 d，鈣聯(lián)蛋白表達(dá)比對照組作用相同時間的表達(dá)明顯增強(qiáng)(圖2)。

3 討論

視神經(jīng)是連接視網(wǎng)膜神經(jīng)元與腦的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的白質(zhì)束。視神經(jīng)的球后段周圍包繞著腦膜，包括軟腦膜、蛛網(wǎng)膜和硬腦膜，腦脊液(cerebral spinal fluid，CSF)充滿于腦、脊髓以及視神經(jīng)周圍的蛛網(wǎng)膜下隙中。MECs襯于三層鞘膜的表面，直接與CSF相接觸，因此覆蓋視神經(jīng)腦膜的MECs形成腦脊液-視神經(jīng)屏障，有效地將視神經(jīng)與腦脊液分離，為視神經(jīng)對抗外界刺激創(chuàng)造了一個好的微環(huán)境。我們前期研究表明腦脊液-視神經(jīng)屏障的主要細(xì)胞成分MECs具有吞噬作用[2]，通過攝取物質(zhì)獲得營養(yǎng)，同時排出異物顆粒和細(xì)胞碎屑，MECs的這種功能在清除CSF的廢物中發(fā)揮重要的作用，從而維持CSF的平衡和免疫反應(yīng)。視盤水腫患者的腦脊液動力學(xué)有所改變[3]，Pache等[4]對MECs在青光眼視神經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔所形成的細(xì)胞巢的研究，提示MECs可能在視神經(jīng)疾病的發(fā)病機(jī)制中起著一定的作用。

Figure 1 Effects of hypoxia on mitochondrial membrane potential of MEC.The intensity of influorescense staining(A) was stronger than that of hypoxia group(B) 缺氧對MECs膜電位的影響。對照組MECs的細(xì)胞熒光強(qiáng)度(A)較缺氧組增強(qiáng)(B)

Figure 2 Effects of hypoxia on expression of calnexin in MEC.The meningothelial cells exposed to hypoxia presented more obvious influorescence staining than normoxia group which treated with the same length of time 缺氧對MECs鈣聯(lián)蛋白表達(dá)的影響。暴露于缺氧條件下的MECs鈣聯(lián)蛋白染色后綠色熒光強(qiáng)度較作用相同時間的對照組增強(qiáng)。Normoxia：對照組；Hypoxia：缺氧組；Calnexin：鈣聯(lián)蛋白；DAPI：4’，6-二脒基-2-苯基吲哚；Merge：融合圖像

我們前期研究提示[5]，缺氧抑制培養(yǎng)的MECs的增殖，并使細(xì)胞直徑增大、體積增加，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹。此外，缺氧抑制MECs產(chǎn)生ATP，細(xì)胞色素C彌散至細(xì)胞質(zhì)中增多。本研究進(jìn)一步探討氧化應(yīng)激對MECs膜電位及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的影響，研究結(jié)果顯示，MECs經(jīng)缺氧作用后，T-AOC水平下降，其機(jī)制可能為：缺氧使細(xì)胞線粒體功能發(fā)生障礙，進(jìn)一步影響線粒體呼吸鏈的功能，使活性氧的產(chǎn)生量增加，對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，使T-AOC水平下降，抗氧化能力降低。同時，缺氧使鈣聯(lián)蛋白表達(dá)上調(diào)可能與其激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)折疊及組裝的場所，負(fù)責(zé)修飾和轉(zhuǎn)運(yùn)合成的蛋白質(zhì)到達(dá)正確的目標(biāo)位置或細(xì)胞外區(qū)域，只有正確折疊的蛋白質(zhì)才能分泌進(jìn)入高爾基體。鈣聯(lián)蛋白作為定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣離子結(jié)合蛋白，和分子伴侶Hsp60、Hsp70、Hsp90相似，也是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的伴侶蛋白，可協(xié)助蛋白質(zhì)組裝，并使未組裝的蛋白亞基滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)。通過對錯誤折疊蛋白和未組裝蛋白的滯留，鈣聯(lián)蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中對蛋白的質(zhì)量控制起重要作用。在缺氧、氧化應(yīng)激、異常糖基化反應(yīng)以及鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡等情況下，影響蛋白質(zhì)的折疊過程，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[6]。一定程度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)能激活細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白基因表達(dá)的增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可通過未折疊蛋白反應(yīng)抑制蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)肽鏈折疊并阻止未折疊蛋白的聚集，起到細(xì)胞保護(hù)作用；若內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)持續(xù)存在，應(yīng)激強(qiáng)度超過細(xì)胞自身處理能力時，未折疊蛋白反應(yīng)啟動凋亡，以去除受損傷的細(xì)胞[7-8]。鈣聯(lián)蛋白作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中重要的類凝集素分子伴侶，通過參與未折疊蛋白反應(yīng)募集凋亡相關(guān)因子、激活I(lǐng)RE1-JNK激酶等途徑，調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的凋亡。過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也可能涉及線粒體及細(xì)胞色素C的協(xié)同作用而使天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶激活和細(xì)胞凋亡。這與我們前期研究在缺氧條件下MECs產(chǎn)生ATP下降以及細(xì)胞色素C從線粒體釋放增多相一致。此外，本研究結(jié)果提示在缺氧條件下MECs膜電位降低，可能由于活性氧損傷線粒體膜，同時會導(dǎo)致鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到細(xì)胞液中，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣離子儲備降低，從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體功能障礙。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子穩(wěn)態(tài)的破壞可引起細(xì)胞凋亡，許多疾病的發(fā)病機(jī)制都與線粒體損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的凋亡有關(guān)。

缺氧所引起MECs線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等功能的損害會導(dǎo)致對視神經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔的生物活性物質(zhì)或廢物的清除[9-11]。青光眼視神經(jīng)的蛛網(wǎng)膜下腔的MECs巢明顯增多[4]以及視神經(jīng)腔室征中有大量的神經(jīng)脫髓鞘和神經(jīng)元的喪失[12]，可能與MECs損傷后影響視神經(jīng)周圍很有限的腔隙中的CSF的流速和組成成分，使CSF中生物活性物質(zhì)積聚而產(chǎn)生神經(jīng)毒性有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病、帕金森癥以及視神經(jīng)損傷導(dǎo)致的神經(jīng)退行性改變與氧化應(yīng)激引起的線粒體功能失調(diào)相聯(lián)系[13-16]。

通過以上研究表明在缺氧條件下MECs可能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體功能的異常以及細(xì)胞內(nèi)吞噬功能的減退[2]，提示缺氧對MECs的損害是多機(jī)制造成的。

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date：Jun 9，2014

Accepted date：Aug 11，2014Foundation item：National Natural Science Foundation of China(No：81160122)；Natural Science Foundation of Qinghai(No：2014-Z-913)From theDepartmentofOphthalmology，QinghaiRedCrossHospital(XIN Xiao-Rong)，Xining810000，QinghaiProvince，China；BloodResearchLaboratory，ChenduBloodCenter(GONG Tian-Xiang)，Chengdu610041，SichuanProvince，China

Responsible author：XIN Xiao-Rong，E-mail：xrgc19@hotmail.com

Effects of hypoxia on endoplasmic reticulum and mitochondrial membrane potential in human meningothelial cells in cerebral fluid-optic nerve barrier

XIN Xiao-Rong，GONG Tian-Xiang

hypoxia；meningothelial cells；endoplasmic reticulum；mitochondrial membrane potential；calnexin；cerebral spinal fluid-optic nerve barrier

Objective To investigate the possible role of meaningothelial cells(MEC) involving in the pathogenesis of optic nerve diseases，and explore the effects of hypoxia on functional changes in MEC.Methods The total anti-oxidative capacity(T-AOC) of MEC were investigated and compared by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) after cells exposed to 21% O2(normoxia group) and 1% O2(hypoxia group) condition for 1 day and 2 days，respectively.Mitochondrial membrane potential was detected and compared by staining with MitoTracker Red after MEC were incubated in normoxia and hypoxia environment for 2 days，and fluorescence staining of calnexin was performed to asses the impact of oxidative stress on the function of endoplasmic reticulum of MEC.Results Compared with the control group，the oxidative stress was decreased in cells treated with hypoxia.An inhibitory effect of hypoxia on T-AOC of MEC exhibited in our study.T-AOC of MEC in the normoxia and hypoxia group for 1 day was(0.012 4+0.001 1)U·L-1and(0.011 9+0.009 0)U·L-1，respectively，there was no statistical difference(t=0.915，P=0.382).The production of T-AOC of MEC decreased after cells exposure to hypoxia(0.010 7+0.008 3)U·L-1for 2 days compared with the normoxia group(0.012 9+0.008 7)U·L-1for the same length of exposure time，there was significant difference(t=4.616，P=0.001).After incubation with different oxygen environment for 2 days，the mitochondrial membrane potential decreased in hypoxia group compared with the control group by the analysis of fluorescent probe under the confocal microscope；meanwhile fluorescense staining revealed that intensity of the green fluorescence of calnexin of MEC in the normoxia group was weaker than that in the hypoxia group by immunofluorescense microscope.Conclusion Hypoxia may affect the oxidative stress of MEC by disturbing the endoplasmic reticulum and mitochondria.

辛?xí)匀?，鞏天?缺氧對腦脊液-視神經(jīng)屏障中腦膜上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體膜電位的影響[J]. 眼科新進(jìn)展，2014，34(11)：1009-1012.

10.13389/j.cnki.rao.2014.0280

辛?xí)匀?，女?971年10月出生，青海民和人，博士，主任醫(yī)師。E-mail：xrgc19@hotmail.com

About XIN Xiao-Rong：Female，born in October，1971.Doctor degree.Chief physician.E-mail：xrgc19@hotmail.com

2014-06-09

國家自然科學(xué)基金資助(編號：81160122)；青海省自然科學(xué)基金項目(編號：2014-Z-913)

810000 青海省西寧市，青海紅十字醫(yī)院眼科(辛?xí)匀?；610041 四川省成都市，成都血液中心研究室(鞏天祥)

辛?xí)匀?，E-mail：xrgc19@hotmail.com

修回日期：2014-08-11

本文編輯：董建軍

[Rec Adv Ophthalmol，2014，34(11)：1009-1012]