布娟 劉敬 李愛軍 陸遙 龐宏蕾 劉峰 王樂今

【應(yīng)用研究】

常染色體顯性遺傳眼球震顫家系的臨床表型及致病基因的研究△

布娟 劉敬 李愛軍 陸遙 龐宏蕾 劉峰 王樂今

注：布娟、劉敬同為第一作者！

About BU Juan：Female，born in March，1973.Medical doctor.Tel：13717531820；E-mail：bujuan110@163.com

About LIU Jing：Female，born in May，1971.Medical doctor.Tel：13811854669；E-mail：jingliuliqun@sina.com

Accepted date：Jul 29，2014Foundation item：National Natural Science Foundation of China(No：81300789)From theDepartmentofOphthalmology，theThirdHospitalofPekingUniversity，Beijing100191，China

Responsible author：WANG Le-Jin，E-mail：wanglejin_puec@sina.com

先天性眼球震顫；常染色體顯性遺傳；PAX6基因；FRMD7基因；GPR143基因

目的 研究1個(gè)中國人常染色體顯性遺傳性眼球震顫家系的臨床特點(diǎn)，并通過候選基因直接測序的方法對該家系的致病基因及發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究。方法 選擇1個(gè)先天性眼球震顫家系，對家系所有成員進(jìn)行全身檢查及視力、眼位、眼球運(yùn)動、眼球震顫中間帶、驗(yàn)光等眼科的相關(guān)檢查后，從家系中每一代各選1例患者(包括先證者)及正常人，進(jìn)行候選基因FRMD7、GPR143與PAX6基因的外顯子測序。結(jié)果 家系患者的眼球震顫為水平?jīng)_動型，并且具有中間帶。除了先證者有部分眼組織缺損及小眼球等異常外，其余患者的眼前節(jié)均未見明顯發(fā)育異常。家系患者PAX6基因第7外顯子的第382堿基發(fā)生了雜合突變(c.C382T)，從而引起了氨基酸的改變(p.R128C)，該突變可能影響了PAX6蛋白與其調(diào)控的下游基因的調(diào)控序列的結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致PAX6基因功能異常，影響眼部發(fā)育。結(jié)論 該常染色體顯性遺傳性眼球震顫家系的致病基因?yàn)镻AX6基因。

[眼科新進(jìn)展，2014，34(11)：1042-1044]

先天性眼球震顫(congenital nystagmus，CN)常發(fā)生于剛出生時(shí)或生后3個(gè)月內(nèi)，表現(xiàn)為不自主地、節(jié)律性或往復(fù)性地眼球擺動或跳動。在CN患者中，有少部分人在向某一方向注視時(shí)，眼球震顫的幅度及頻率明顯減輕，即存在中間帶，稱為先天性特發(fā)性眼球震顫(congenital idiopathic nystagmus，CIN)。有7% ～30% 的CIN患者具有遺傳傾向，最常見的遺傳方式是X染色體連鎖遺傳。近年來，隨著分子遺傳學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展，有關(guān)CIN的基因定位與致病基因克隆取得了很大的進(jìn)展[1-2]。已知的致病基因有酵母功能域包含蛋白7(FRMD7)和GPR143。

本研究收集了1個(gè)4代CIN家系，其遺傳方式是較為少見的染色體顯性遺傳，對家系患者進(jìn)行了臨床表型的研究和FRMD7、GPR143、PAX6基因的突變篩查。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象取自在北京大學(xué)眼科中心就診的一個(gè)CIN大家系，家系68名成員中共有11例患者，其遺傳方式符合常染色體顯性遺傳。本研究遵循赫爾辛基宣言，在家系所有成員均知情同意的情況下，抽取家系中11例患者和12例正常人的外周血8～10 mL，并對他們進(jìn)行全面的檢查。

1.2 方法

1.2.1 眼科檢查 詳細(xì)詢問病史及家族史后進(jìn)行視力、眼位、眼球運(yùn)動、眼球震顫中間帶、驗(yàn)光等相關(guān)檢查。使用復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳進(jìn)行裂隙燈顯微鏡和檢眼鏡檢查以排除眼前節(jié)及眼底病變。根據(jù)臨床體征和檢查結(jié)果，確定患者和正常人。診斷標(biāo)準(zhǔn)：第一眼位出現(xiàn)顯性眼球震顫者為陽性。

1.2.2 基因組DNA的提取 抽取外周血8～10 mL，分離提取基因組DNA，紫外分光光度計(jì)和6 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測樣本DNA純度和濃度。加入1000 μL TE，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 FRMD7、GPR143與PAX6基因突變檢測 從家系中每一代各選1例患者及正常人，其中一人為先證者，通過下列引物對FRMD7、GPR143與PAX6基因的外顯子(exon)、5’和3’ 端非編碼區(qū)(untranslated region，UTR)以及內(nèi)含子(intron)與外顯子拼接處序列進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體系為：10×緩沖液5 μL(Mg2+濃度為1.5 mmol·L-1)，4×dNTP 8 μL(2.0 mmol·L-1)，上、下游引物各0.5 μL(20 pmol·μL-1)，Taq DNA聚合酶0.5 μL(5 U·μL-1)，模板DNA 1 μL(100 ng·μL-1)，加消毒雙蒸水至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性 30 s，60～62 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s后延伸7 min，30～35個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以觀察擴(kuò)增效率，剩余PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)20 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化回收后直接進(jìn)行測序。

2 結(jié)果

2.1 眼科檢查 經(jīng)家系系譜調(diào)查和全面的眼科檢查發(fā)現(xiàn)，該家系中發(fā)病者在4代系譜中連續(xù)出現(xiàn)，患者雙親中有一方患病，則患者子女中有1/2發(fā)病，且男女患病機(jī)會均等，符合常染色體顯性遺傳特點(diǎn)。該家系發(fā)病的特點(diǎn)是出生后即雙眼患病(家系患者的臨床表型見表1)，雙眼水平?jīng)_動型眼球震顫，具有中間帶及代償頭位。雙眼在頭正位下的矯正視力為0.10～0.60，雙眼在代償頭位下的矯正視力為0.25～1.00。裂隙燈顯微鏡檢查僅先證者有部分虹膜缺損、脈絡(luò)膜缺損、小眼球，其余患者眼前節(jié)均未見明顯發(fā)育異常。所有患者均未合并全身其他系統(tǒng)異常。

表1 家系患者眼科檢查

Table1 Ophthalmologic test of both eyes of affected individuals with nystagmus

CodeSexAge/yearCorrectedvisualacuity(OU)NormalpositionAbnormalheadpositionDiagnosisⅢ-1Female780.300.60Nystagmus、Cataract(OU)Ⅲ-7Female640.100.25Nystagmus、Cataract(OU)Ⅲ-12Male600.200.40Nystagmus、Cataract(OD)Ⅳ-1Female550.600.80NystagmusⅣ-3Female530.300.60NystagmusⅣ-5Female470.601.00NystagmusⅣ-16(proband)Female380.250.30Nystagmus、Congenitalmicrophthalmos、Cataract(OU)Colobomaofirisandchoroid(OU)Ⅳ-18Male350.500.80NystagmusⅣ-22Male410.400.60NystagmusⅤ-1Female310.600.80NystagmusⅤ-4Male290.400.80Nystagmus

2.2 基因測序結(jié)果

2.2.1 FRMD7基因、GPR143基因測序 家系患者FRMD7基因、GPR143基因所有外顯子以及內(nèi)含子與外顯子拼接處序列測序均未見突變。

2.2.2 PAX6基因測序 先證者及家系患者PAX6基因第7外顯子的第382堿基發(fā)生了雜合突變(c.C382T)，從而引起了氨基酸的改變(p.R128C，圖1)。該突變在家系正常人及正常對照者中未檢出。

3 討論

由于CN發(fā)生于視覺發(fā)育早期，故而對患者的雙眼視功能造成嚴(yán)重的損害。部分CN患者由于存在靜止眼位或中間帶(即當(dāng)雙眼向某一方向注視時(shí)眼球震顫可明顯減輕或消失)，眼部也無異常改變，患者常采取代償頭位。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對于這部分眼球震顫病例的發(fā)病機(jī)制研究有了很大的進(jìn)展。

Figure 1 The PAX6 sequence of the patients with nystagmus 眼球震顫患者PAX6 基因測序結(jié)果

CIN的遺傳方式以X染色體連鎖遺傳最常見。由于CIN具有很高的遺傳異質(zhì)性，且遺傳的復(fù)雜性、染色體的隨機(jī)失活使其分子機(jī)制的研究更為復(fù)雜。目前，已知的與CIN有關(guān)的致病基因有FRMD7和GPR143基因。

FRMD7基因有12個(gè)外顯子，編碼714個(gè)氨基酸，組成FRMD7，是超家族蛋白的成員之一。FRMD7基因主要在早期胚胎(孕56 d)的前腦室、中腦、小腦原基、脊索及正在發(fā)育的神經(jīng)視網(wǎng)膜中表達(dá)，在孕37 d胚胎則主要在中腦和后腦表達(dá)，而此區(qū)域被視為眼球運(yùn)動控制中樞所在地[3-5]。

GPR143基因包含9個(gè)外顯子，編碼404個(gè)氨基酸，含有7個(gè)跨膜區(qū)域，屬于G蛋白耦聯(lián)受體。GPR143基因最初被鑒定為眼白化病致病基因，其突變會引起眼球色素的減少、畏光和視敏度的降低。GPR143基因主要表達(dá)在皮膚和眼的色素細(xì)胞上，它位于細(xì)胞內(nèi)黑色素小體膜上，調(diào)節(jié)黑色素的發(fā)生和成熟[6-7]。關(guān)于GPR143基因突變導(dǎo)致CIN 的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚，推斷GPR143基因突變可能阻斷了一條重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，造成眼球運(yùn)動傳導(dǎo)系統(tǒng)功能缺陷[8-9]。

PAX6基因編碼一個(gè)含有422個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子屬于同源異型框蛋白家族成員，主要調(diào)控眼睛的發(fā)育和其他發(fā)育過程。PAX6基因定位于染色體11q13～14區(qū)間，包含13個(gè)外顯子。PAX6蛋白包含配對結(jié)構(gòu)域、同源異型結(jié)構(gòu)域、富含脯氨酸-絲氨酸-蘇氨酸的結(jié)構(gòu)域[10]。PAX6 基因是眼球發(fā)育中極為重要的基因，是絕大多數(shù)先天性無虹膜病例的致病基因[11-16]，在 PAX6 雜合突變眼中，眼前段組織發(fā)育受到嚴(yán)重的損害，如小梁網(wǎng)分化不良、角膜上皮層變薄、虹膜異常、白內(nèi)障等。

本研究鑒定的p.R128C突變位于配對結(jié)構(gòu)域的C末端，突變可能影響了PAX6蛋白與其調(diào)控的下游基因的調(diào)控序列的結(jié)合，進(jìn)而引起與眼睛發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)異常，從而導(dǎo)致該家系先證者的眼球震顫、白內(nèi)障、小眼球、虹膜缺損等臨床表現(xiàn)。

PAX6基因的p.R128C突變曾被報(bào)道過2次，Azuma等[17]在一個(gè)日本的常染色體顯性遺傳的單純性中心凹發(fā)育不良家系中鑒定了一個(gè)p.R128C突變，該家系的所有患者均表現(xiàn)為先天性的單純性中心凹發(fā)育不良伴隨正常的眼前段結(jié)構(gòu)以及眼球震顫，中心凹光反射消失，眼底圖像顯示視網(wǎng)膜血管穿過中心凹區(qū)域。van Heyningen等[18]在一個(gè)歐洲的病例中鑒定了同樣的突變，患者具有和Azuma等[17]報(bào)道的一樣的表型。但在我們的研究中，家系內(nèi)患者表現(xiàn)出不同于以往報(bào)道的臨床表型，所有患者均表現(xiàn)為CIN，除了先證者還表現(xiàn)出白內(nèi)障、小眼球、虹膜缺損等眼前段結(jié)構(gòu)異常外，其余患者并無眼前節(jié)及眼底的異常。這提示同樣的突變在不同的遺傳環(huán)境下可能會引起不同的臨床表型，所以本研究所鑒定的PAX6蛋白p.R128C突變進(jìn)一步證實(shí)了PAX6基因突變的臨床異質(zhì)性。

由于CN目前尚無有效的治療方法，只有對該病的不同遺傳方式和發(fā)病機(jī)理有了清晰認(rèn)識，才能夠利用遺傳學(xué)手段為CN患者提供準(zhǔn)確的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷服務(wù)，探索新的治療途徑。

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date：May 26，2014

Clinical and genetic study of autosomal dominant congenital nystagmus family

BU Juan，LIU Jing，LI Ai-Jun，LU Yao，PANG Hong-Lei，LIU Feng，WANG Le-Jin

congenital nystagmus；autosomal dominant；PAX6 gene；FRMD7 gene；GPR143 gene

Objective To study the clinical phenotype in a Chinese family with congenital nystagmus and determine the disease-causing mutation.Methods A detailed clinical ophthalmic and complete physical examinations were performed for all patients in the congenital nystagmus family.Mutations in PAX6，F(xiàn)RMD7 and GPR143 were determined by PCR-based DNA sequencing assays and multiplex PCR assays for deletions.Results The affected members in the pedigree had classical phenotype of nystagmus.The type of nystagmus in the family was jerk nystagmus with null-point.Only the proband had ocular coloboma and congenital cataract.The missense mutation R128C(caused by a 382 C→T heterozygous change) in PAX6 was identified in the Chinese congenital nystagmus family.The mutation was associated with the disease phenotype in patients，but not detected in their relatives or in the 100 normal controls.Conclusion The missense mutation of PAX6 is the molecular basis for the congenital nystagmus family.

布娟，劉敬，李愛軍，陸遙，龐宏蕾，劉峰，等.常染色體顯性遺傳眼球震顫家系的臨床表型及致病基因的研究[J].眼科新進(jìn)展，2014，34(11)：1042-1044.

10.13389/j.cnki.rao.2014.0288

布娟，女，1973年3月出生，山東人，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師。主要研究方向?yàn)樾币暸c小兒眼科、眼科遺傳學(xué)。聯(lián)系電話：13717531820；E-mail：bujuan110@163.com

作者簡介：劉敬，女，1971年5月出生，山東人，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師。研究方向?yàn)樾币暸c小兒眼科學(xué)、眼科遺傳學(xué)。聯(lián)系電話：13811854669；E-mail：jingliuliqun@sina.com

2014-05-26

國家自然科學(xué)基金資助(編號：81300789)

100191 北京市，北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科

王樂今，E-mail：wanglejin_puec@sina.com

修回日期：2014-07-29

本文編輯：付中靜

[Rec Adv Ophthalmol，2014，34(11)：1042-1044]