李啟照，尹 偉，戴一

（安徽新華學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 合肥 230088）

三七保健酒中三七皂苷含量測(cè)定與加速穩(wěn)定性研究

李啟照，尹 偉，戴一

（安徽新華學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 合肥 230088）

目的：通過(guò)對(duì)三七保健酒中功效成分的測(cè)定和穩(wěn)定性研究,建立具有明確功能的重要成分的質(zhì)量指標(biāo),有效保證保健酒的產(chǎn)品品質(zhì).方法：選擇保健酒中皂苷建立符合相關(guān)要求規(guī)定的檢測(cè)方法,采用高效液相色譜法檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行加速穩(wěn)定性試驗(yàn).結(jié)論:該方法穩(wěn)定、快速準(zhǔn)確、精密度高、重現(xiàn)性好,可用于三七保健酒的質(zhì)量控制.為三七保健酒的開(kāi)發(fā)利用提供參考.

三七保健酒；三七皂苷；高效液相色譜法；穩(wěn)定性

三七保健酒是根據(jù)經(jīng)典秘方選用三七、枸杞、桂圓、米酒等多味中藥，采取現(xiàn)代中藥超微粉碎技術(shù)及濃縮提取工藝研制生產(chǎn)而成的純中藥制劑.具有止血生肌，消腫止痛，舒筋活血，活血祛瘀.君藥三七主要有效成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1，為保證三七保健酒質(zhì)量，本文采用HPLC測(cè)定了三七藥材中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的含量.同時(shí)進(jìn)行加速穩(wěn)定性試驗(yàn).

1 儀器與試劑

高效色譜儀Aglient1260，G1315D檢測(cè)器；三七皂苷對(duì)照品：三七R1(批號(hào)120704-200923)，人參Rg1(批號(hào)1207-200917)，人參Rb1(批號(hào)120745-200815)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；三七藥材，由安徽新華學(xué)院藥學(xué)院生藥教研室鑒定；乙腈、甲醇均為色譜純.

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定方法選擇

本品處方由三七、枸杞、桂圓、紅花等十幾味中藥組成，三七為君藥選擇作為該制劑含量測(cè)定藥材.三七中主要含三七素、三七皂苷等成分，研究表明[1]，三七中的有效活性部位為三七皂苷，三七皂苷的含量測(cè)定方法文獻(xiàn)報(bào)道有比色法、薄層掃描法、HPLC法等，其中HPLC法報(bào)道較多，該法被藥典收載較為靈敏準(zhǔn)確，因此本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定三七保健酒中三七皂苷R1+人參皂苷Rb1+Rg1的含量，作為考察其制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)[2].據(jù)藥典的方法及參照文獻(xiàn)人參皂苷Rg1和Rb1及三七皂苷R1提取條件，乙醚脫脂處理后，使用甲醇索氏提取，萃取總皂苷用水飽和正丁醇反復(fù)萃取，用水洗除雜，除去干擾的其它成分，從而使定量分析的結(jié)果更加準(zhǔn)確[3].

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜柱：Vp-ODS150×4.6mm；流動(dòng)相：乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫；流速為1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)203nm，柱溫30℃.理論板數(shù)按三七皂苷R1峰計(jì)算應(yīng)不低于4000.參照藥典三七項(xiàng)下高效液相色譜法中的液相條件，優(yōu)化出本試驗(yàn)的流動(dòng)相梯度，乙腈∶水(15∶85 12 min 30∶70 45min15∶85v/v).

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定人參皂苷Rb1、Rg1和三七皂苷R1對(duì)照品適量加甲醇，分別制成每1mL含人參皂苷Rb10.4mg、Rg10.4mg和三七皂苷R10.1mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液.

2.3.2 供試品溶液的制備

精密吸取三七保健酒10mL，置索氏提取器中，加適量乙醚，加熱回流1小時(shí)，棄去乙醚液，藥渣揮去乙醚；置索氏提取器中，加適量甲醇，加熱提取至甲醇無(wú)色，揮干甲醇提取液，殘?jiān)铀?0mL溶解，用水飽和的正丁醇提取3次（20mL，20mL，15mL），合并提取液，再用30mL正丁醇飽和的水洗滌，水洗液棄，蒸干正丁醇液，殘?jiān)蛹状既芙?，定量轉(zhuǎn)移至25mL量瓶?jī)?nèi)，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液[4].

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

精密稱取適量對(duì)照品人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1，加甲醇分別制成每1mL含人參皂苷Rg10.4mg、人參皂苷Rb10.4mg和三七皂苷R10.1mg的混合溶液，即得.吸取4μl、8μl、12μl、16μl、20μl進(jìn)樣測(cè)定，以三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及 Rb1對(duì)照品溶液進(jìn)樣量（μl）為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸,回歸方程和相關(guān)系數(shù)為:Y=84396X+75747,r=0.9990(n=5)；Y=57175X -187.2,r=0.9992(n=5)；Y=12266X-1475.8,r=0.9996 (n=5).結(jié)果表明:人參皂苷Rg1在1.65～8.32μg、人參皂苷Rb1在1.58～7.85μg、三七皂苷R1在0.425～2.16μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好[5]. 2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

依藥典含量測(cè)定項(xiàng)下方法，精密吸取供試品溶液于0、2、4、6、8小時(shí)分別進(jìn)樣一針，記錄色譜圖，對(duì)本品溶液穩(wěn)定性情況進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)得人參皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1的RSD分別為1.42%，1.26%和1.22%.表明本品溶液的穩(wěn)定性較好，結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 穩(wěn)定性性試驗(yàn)考察表

2.6 精密度試驗(yàn)

按照藥典含量測(cè)定項(xiàng)下方法，分別精密吸取供試品溶液10μl，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖，對(duì)本法的精密度情況考察分析，結(jié)果測(cè)得人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1的RSD分別為1.29%，1.36%，1.49%.表明本法精密度較好.結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 精密度試驗(yàn)考察表

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

按含量測(cè)定項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取同一批號(hào)的本品試樣，精密稱取5份制備供試品溶液.各吸取10μl分別注入液相色譜儀，測(cè)定其峰面積，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1的RSD分別為1.47%，1.42%，1.39%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本法重現(xiàn)性較好，結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 重現(xiàn)性試驗(yàn)考察表

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

制取供試品溶液:精密量取試樣10mL與索氏提取器中，同時(shí)精密稱取人參皂苷Rb1、Rg1和三七皂苷R1適量,分別加入上述索氏提取器中，按照上述方法制取供試品溶液.精密吸取10μL供試品溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，分別計(jì)算其回收率.人參皂苷Rb1、Rg1、和三七皂苷R1的平均回收率分別為98.29%，98.22%，98.31%.RSD%分別為1.13%，1.22%，1.34%.實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合相關(guān)要求.結(jié)果見(jiàn)表4，表5，表6.

樣品中含量(mg) 加入對(duì)照品量(mg) 實(shí)測(cè)含量(mg) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%) 1.66 1.80 3.426 97.87 1.71 1.80 3.435 96.95 1.77 1.80 3.592 98.91 98.29 1.13 1.81 1.80 3.654 99.45 1.67 1.80 3.464 98.31

表6 三七皂苷R1加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

表5 人參皂苷Rg1加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品的含量測(cè)定

根據(jù)藥典規(guī)定：三七藥材中三七皂苷R1+人參皂苷Rb1+Rg1的含量應(yīng)不得低于5.0%；據(jù)此折算三七保健酒中三七皂甙R1+人參皂苷Rb1+Rg1的理論含量應(yīng)不得低于8mg/mL，經(jīng)對(duì)三批三七保健酒進(jìn)行含量測(cè)定，三七皂甙R1+人參皂苷Rb1+Rg1的總含量為8.27-11.35mg/mL.根據(jù)保健食品有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定考慮實(shí)際生產(chǎn)的特點(diǎn)，將其下限定為合量限度，即本品每mL含三七皂甙R1+人參皂苷Rb1+ Rg1應(yīng)不低于8.0mg/mL. 2.10加速穩(wěn)定性試驗(yàn)

圖5 對(duì)照品的HPLC圖譜

圖6 藥材的HPLC圖譜

圖7 人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1混合對(duì)照品HPLC圖譜

圖8 三七藥材HPLC圖譜

將三批樣品在溫度20℃±5℃，相對(duì)濕度70% ±5%的條件下放置3個(gè)月，在0個(gè)月、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月定期進(jìn)行各項(xiàng)測(cè)定.按照GB2757—81《蒸餾酒及配制酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》、GB2758—81《發(fā)酵酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》、QB/T1981—94《露酒》標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求研究三七保健酒的穩(wěn)定性.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：三批樣品在感官指標(biāo)棕紅色藥香、酒香協(xié)調(diào)，口感醇厚、色澤透明、有光澤、無(wú)異味、無(wú)沉淀物；生物穩(wěn)定性在120、126、128、132德勒度；藥汁量（w/w）在12%、12.6%、12.9%、13.4%；總糖（以葡萄糖計(jì)）g/L為97、113、118、121；總酸（以乙酸計(jì)）g/L在5.6、6.1、6.4、6.7；衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)均符合GB/T5009.48規(guī)定控制菌數(shù)未檢出.通過(guò)三批試樣的加速穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)，三七保健酒各項(xiàng)指標(biāo)沒(méi)有明顯的變化，質(zhì)量穩(wěn)定.

3 討論

藥典中未見(jiàn)三七保健酒的含量測(cè)定項(xiàng)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)三七保健酒的有效質(zhì)量控制；參照《中國(guó)藥典》2010年版一部中三七含量測(cè)定方法，并結(jié)合本制劑特點(diǎn)采用高效液相色譜法，測(cè)定三七藥材中人參皂苷Rb1+Rg1+三七皂甙R1的含量.作為控制三七保健酒的質(zhì)量的方法.方法穩(wěn)定，精密度高，重現(xiàn)性好，快速準(zhǔn)確，能較好地對(duì)生產(chǎn)過(guò)程中的原藥材及成品進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控，提高了制劑標(biāo)準(zhǔn)的可行性及可靠性.可作為該制劑質(zhì)量控制方法.穩(wěn)定性檢查研究，按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)三批樣品的感官指標(biāo)、生物穩(wěn)定度、藥汁量、總糖、總酸及衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)進(jìn)行檢查，結(jié)果樣品各項(xiàng)指標(biāo)均符合要求.三七保健酒穩(wěn)定性較好.

〔1〕國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部). [M]北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010.7，10.

〔2〕陳玉勇,秦楓,朱海燕.三七總皂苷的乙醇超聲法提取工藝及急性毒性研究 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008(7)：40-41.

〔3〕葛竹興,秦楓.高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)三七總皂苷中Rg_1和Re的含量[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)刊,2008(9)：121-123.

〔4〕孔繁晟,賁永光,曾昭智.三七總皂苷超聲提取工藝研究[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào),2011(4)：36-37.

〔5〕侯茂奇,王長(zhǎng)虹,楊莉.正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選三七總皂苷的提取工藝研究[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2009 (4)：47-48.

〔6〕周家明，高明菊，趙愛(ài).從鮮三七根莖中提取三七總皂苷的工藝研究[J].中國(guó)產(chǎn)業(yè),2011(5)：111-113.

R284

A

1673-260X（2014）04-0128-04

安徽教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目（KJ2012B071）；校級(jí)質(zhì)量工程（2011Rcpyx01;2012xwsjx07)