龍石太+吳憲紅+胡亮+字向東

摘要：以川中黑山羊肝臟組織總RNA為模板，通過RT-PCR技術(shù)對(duì)黑山羊RBP4基因進(jìn)行克隆測(cè)序及序列分析。結(jié)果表明，所克隆的665 bp片段為預(yù)期的川中黑山羊RBP4基因cDNA序列，包含整個(gè)CDS區(qū)，該編碼區(qū)長(zhǎng)為606 bp，編碼201個(gè)氨基酸。用DNAMAN軟件進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示，川中黑山羊RBP4基因編碼區(qū)與GenBank中報(bào)道的牛、豬、馬、黑猩猩、小鼠、大鼠、人的同源性分別是98.5%、91.3%、92.2%、91.4%、83.0%、82.3%、91.3%；氨基酸序列同源性分別為97.5%、91.5%、93.5%、91.5%、83.6%、83.6%、91.5%。利用NJ法和MP法以該基因編碼區(qū)核苷酸序列構(gòu)建物種間分子進(jìn)化樹，其結(jié)果基本一致。聚類結(jié)果與遺傳距離大小一致，表明RBP4基因編碼區(qū)適用于構(gòu)建物種間分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。

關(guān)鍵詞：川中黑山羊；RBP4基因；分子克??；序列分析

中圖分類號(hào)：S826；Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）03-0697-04

視黃醇結(jié)合蛋白（Retinol-binding proteins，RBPs）是存在于動(dòng)物體內(nèi)以實(shí)現(xiàn)維生素A從肝細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至靶組織，并參與血清和細(xì)胞內(nèi)視黃酸、視黃醇轉(zhuǎn)運(yùn)代謝的一種特異性運(yùn)載蛋白，類屬于疏水小分子結(jié)合蛋白家族[1]。RBPs在協(xié)助維生素A發(fā)揮生理功能中起著不可替代的作用。首先，RBP與維生素A結(jié)合后再與甲狀腺素運(yùn)載蛋白結(jié)合，形成VA-RBP-TTR復(fù)合體，伴隨血液循環(huán)流經(jīng)靶組織，與RBP的可識(shí)別受體結(jié)合，然后將維生素A轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)的受體上，以此完成其運(yùn)載功能[2]。RBP主要在肝臟細(xì)胞中合成，合成后釋放到血液中，最后通過內(nèi)循環(huán)進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)各組織。但RBP基因的mRNA在哺乳動(dòng)物的卵巢、輸卵管、卵泡、黃體、子宮內(nèi)膜、肝臟、小腸、睪丸和附睪等多種組織中都有表達(dá)，只是在不同物種、組織器官和不同發(fā)育時(shí)期存在表達(dá)差異[3]。研究顯示，視黃醇結(jié)合蛋白4基因（RBP4）在豬妊娠關(guān)鍵期的轉(zhuǎn)運(yùn)作用和胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，從而影響豬的產(chǎn)仔數(shù)[3，4]，RBP4是產(chǎn)生孕體的主要蛋白質(zhì)之一。

目前，有關(guān)RBP基因在人、豬、牛、綿羊、小鼠、大鼠等物種中的研究均有報(bào)道，但在山羊物種中的研究尚未見報(bào)道。繁殖性狀是山羊最為重要的經(jīng)濟(jì)性狀，提高山羊產(chǎn)活羔率是增加山羊經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重要手段，提高山羊繁殖力則普遍成為世界養(yǎng)羊業(yè)所追求的目標(biāo)。而川中黑山羊是經(jīng)過長(zhǎng)期自然選擇和人工重點(diǎn)選育的多胎山羊品種，具有性成熟早（母羊初情期為3～4月齡，初配年齡為5～6月齡）、產(chǎn)仔率高（平均產(chǎn)羔率為270%）、生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)肉性能好、耐粗食、抗病力強(qiáng)、適應(yīng)性良好等優(yōu)點(diǎn)[4，5]。

本研究以川中黑山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，首次對(duì)山羊的RBP4基因CDS區(qū)進(jìn)行克隆測(cè)序及序列分析，與GenBank中其他物種的相應(yīng)基因進(jìn)行序列比對(duì)，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建物種間分子系統(tǒng)進(jìn)化樹，以期為進(jìn)一步開展川中黑山羊RBP4基因的定位、表達(dá)調(diào)控以及繁殖性狀的相關(guān)分析等提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從四川省樂至縣天龍科技示范園選取6只3～5歲健康的黑山羊，屠宰后采集肝臟組織，迅速放置在室溫生理鹽水中，并沖洗3次，放于RNA later 中，然后放置到盛有液氮的液氮罐中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室保存于超低溫冰箱（-70 ℃）中，用于RNA提取。

1.2 主要試劑和儀器

動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒、2×Taq PCR Master Mix、感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自FERMENTAS（MBI）公司，X-Gal、IPTG、氨芐青霉素（Ampr）、克隆載體PMD-19 Vector購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，DNA膠回收試劑盒購(gòu)自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司。

1.3 總RNA的提取

依據(jù)動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒（離心柱型）提取川中黑山羊肝臟總RNA。依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。

1.4 引物設(shè)計(jì)及目的基因PCR擴(kuò)增

參考GenBank已公布的牛視黃醇結(jié)合蛋白（RBP4）基因（登錄號(hào)：NM_001040475）的mRNA序列，應(yīng)用 Primer Premier 5 設(shè)計(jì)1對(duì)引物，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 665 bp，引物序列送上海英俊生物有限公司合成（表1）。以合成的川中黑山羊肝臟cDNA為模板，構(gòu)建25 μL PCR擴(kuò)增體系。上、下游引物各1 μL，cDNA模板0.5 μL，2×Taq PCR Master Mix酶12.5 μL，水10 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃ 變性40 s，60 ℃ 退火40 s，72 ℃ 延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min，4 ℃ 保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 克隆及重組子篩選和鑒定

PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，按DNA膠回收試劑盒說明進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物與PMD-19 載體在16 ℃ 連接過夜。連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑選白色單克隆菌落于LB液體培養(yǎng)基上，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，取菌液進(jìn)行PCR陽性重組子鑒定，并提取重組質(zhì)粒。

1.6 序列及系統(tǒng)進(jìn)化分析

將重組質(zhì)粒送上海英俊生物有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAMAN 4.0 軟件拼接后，與GenBank 中已公布的牛、豬、馬、人、黑猩猩、大鼠、小鼠的RBP4基因進(jìn)行比對(duì)，分析其在核苷酸和相應(yīng)的氨基酸序列上的異同，并使用Mega 4.0 軟件構(gòu)建物種間系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 RBP4基因PCR電泳結(jié)果

以川中黑山羊肝臟cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳（電泳緩沖液為1×TBE）檢測(cè)后，得到與預(yù)期大?。?65 bp）一致的片段（圖1）。

2.2 重組子鑒定

挑選8個(gè)單克隆菌落37 ℃搖菌，培養(yǎng)5 h后，從每管培養(yǎng)基中抽取1 μL作為模板，以原引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)，再用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增的目的片段的大小，結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致（圖2），然后將鑒定后的陽性菌液送上海英俊生物有限公司測(cè)序。

2.3 川中黑山羊RBP4基因CDS序列分析

利用DNAMAN 4.0對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，得到665 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果相符。RBP4基因測(cè)序結(jié)果如圖3所示。用ORF查找器（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）查找RBP4的開放性閱讀框并翻譯出氨基酸序列，結(jié)果表明，RBP4基因含有一個(gè)606 bp的可讀框，起始密碼子為ATG（編碼蛋氨酸），終止密碼子為TAG （不編碼氨基酸），編碼201個(gè)AA。

2.4 RBP4基因核苷酸、氨基酸序列的同源性比對(duì)

2.4.1 核苷酸序列比對(duì)及遺傳距離 將所得的RBP4基因CDS區(qū)與GenBank中查找的其他物種RBP4的CDS區(qū)進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算其序列相似性與遺傳距離。核苷酸序列比對(duì)結(jié)果表明，參與比對(duì)的各物種RBP4基因編碼區(qū)長(zhǎng)度相同，均為606 bp， 沒有發(fā)現(xiàn)不同物種間的特異插入或缺失。

經(jīng)比對(duì)（表2），川中黑山羊RBP4基因 CDS 區(qū)與牛（NM_001040475）、豬（NM_214057）、馬（NM_001081951）、黑猩猩（NM_001045495）、小鼠（NM_001159487）、大鼠（NM_013162）、人（NM_006744）的同源性分別是98.5%、91.3%、92.2%、91.4%、83.0%、82.3%、91.3%，表明川中黑山羊RBP4基因的CDS區(qū)較保守。

由核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果（表2）可知，川中黑山羊RBP4的氨基酸序列與牛、豬、馬、黑猩猩、小鼠、大鼠、人的同源性分別為97.5%、91.5%、93.5%、91.5%、83.6%、83.6%、91.5%。

2.4.2 物種間分子系統(tǒng)進(jìn)化樹 采用鄰接法（NJ）和最大簡(jiǎn)約法（MP）對(duì)川中黑山羊、牛、馬、豬、人、黑猩猩、大鼠、小鼠的核苷酸序列分別構(gòu)建物種間分子系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4、圖5），利用Clustal X軟件進(jìn)行同源性比對(duì)，并計(jì)算RBP4基因核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列的遺傳距離（表3）。結(jié)果表明，2種方法構(gòu)建的物種間分子系統(tǒng)進(jìn)化樹基本一致，且遺傳距離的大小、核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列的同源性一致。

3 小結(jié)與討論

3.1 川中黑山羊RBP4基因核苷酸及其推導(dǎo)氨基酸序列分析

參與比對(duì)的各物種RBP4基因編碼區(qū)均為606 bp，無種屬特異性插入和缺失。采用DNAMAN、Clustal X軟件進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果表明川中黑山羊RBP4基因CDS區(qū)核苷酸序列與牛、豬、馬、黑猩猩、人的同源性都在90%以上，與川中黑山羊親緣關(guān)系最近的是牛，同源性高達(dá)98.5%，二者有10處核苷酸的差異；與小鼠、大鼠同源性為83.0%、82.3%，表明川中黑山羊RBP4基因的CDS區(qū)較保守。川中黑山羊RBP4基因與牛科動(dòng)物遺傳距離很小，僅為0.015，與大鼠的遺傳距離最大，為0.177，表明川中黑山羊與牛的親緣關(guān)系最近，與鼠的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

川中黑山羊RBP4基因推導(dǎo)氨基酸序列與查找的各物種同源性比對(duì)結(jié)果基本一致，其親緣關(guān)系遠(yuǎn)近與核苷酸序列比對(duì)結(jié)果也基本一致。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，與川中黑山羊親緣關(guān)系最近的是牛。

3.2 物種間分子進(jìn)化關(guān)系

川中黑山羊與牛、豬、馬、人、黑猩猩、鼠等物種間的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建結(jié)果表明，NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)樹各分支置信度均在98以上，其中，川中黑山羊與牛聚類時(shí)置信度達(dá)100；MP法構(gòu)建的系統(tǒng)樹中，川中黑山羊和牛聚類時(shí)的置信度也達(dá)到100，除了人和豬聚類時(shí)的置信度為90以外，其他分支的置信度均在98以上，說明這2種方法的聚類結(jié)果可靠性較強(qiáng)。從聚類結(jié)果可以看出，川中黑山羊首先與牛聚為一類，再與馬聚為一類，然后與人、豬聚類，最后與鼠科動(dòng)物聚類。該分子系統(tǒng)進(jìn)化樹較準(zhǔn)確、真實(shí)地反映了各物種間的進(jìn)化關(guān)系和親緣關(guān)系，即親緣關(guān)系越近的物種，同源性越高，遺傳距離越小。

3.3 RBP4基因作為動(dòng)物繁殖力候選基因

RBP4基因作為豬的繁殖力相關(guān)的候選基因已經(jīng)被廣泛研究。楊龍等[3]對(duì)長(zhǎng)白、大白、民豬、杜洛克和雜種豬5種豬的多態(tài)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)這5種豬均表現(xiàn)為中度多態(tài)性，民豬的B等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因，推測(cè)B等位基因與豬的多胎性狀相關(guān)。羅仍卓么等[6]對(duì)北京黑豬RBP4基因的多態(tài)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)BB型比AA型和AB型的總產(chǎn)仔數(shù)分別多1.04頭和0.31頭，B等位基因的加性效應(yīng)為0.282頭/窩。朱吉等[7]對(duì)湖南黑豬的研究發(fā)現(xiàn)，初產(chǎn)母豬的BB基因型比AA基因型個(gè)體總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)分別多1.66、1.83頭。該研究結(jié)論進(jìn)一步支持了B等位基因可能為豬繁殖性能的優(yōu)勢(shì)等位基因。Rothschild等[8]對(duì)6個(gè)商品系1 300頭母豬的2 555頭仔豬進(jìn)行了RBP4標(biāo)記基因型檢測(cè)，其加性效應(yīng)分別為0.23 頭/窩（總產(chǎn)仔數(shù)）和0.15 頭/窩（產(chǎn)活仔數(shù)），表明RBP4基因?qū)Ξa(chǎn)仔數(shù)存在中等增強(qiáng)的效應(yīng)。Ollivier等[9]分析了高產(chǎn)仔系和對(duì)照組母豬，估計(jì)RBP4基因的加性效應(yīng)為0.4頭/窩。Linville等[10]報(bào)道了RBP4對(duì)總產(chǎn)仔數(shù)的加性效應(yīng)為0.179頭/窩，對(duì)產(chǎn)活仔數(shù)的加性效應(yīng)為0.526頭/窩。因此，RBP4基因可作為豬的一個(gè)較為合理的產(chǎn)仔數(shù)候選基因。

RBP4基因作為綿羊的繁殖力候選基因的研究也有報(bào)道，何遠(yuǎn)清等[11]以RBP4為候選基因，檢測(cè) RBP4基因在高繁殖力綿羊品種（湖羊、小尾寒羊）和低繁殖力綿羊品種（薩福克羊、多賽特羊）中的單核苷酸多態(tài)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RBP4基因在4個(gè)綿羊品種中均存在多態(tài)性，且BB基因型小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)分別比AA和AB基因型多0.52只和0.67只。表明RBP4基因與小尾寒羊高繁殖力相關(guān)。在山羊種中，RBP4基因作為繁殖力候選基因尚未見報(bào)道，本研究對(duì)川中黑山羊RBP4基因編碼區(qū)進(jìn)行克隆，旨在為開展山羊RBP4基因的相關(guān)研究提供理論支持。

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RBP4基因作為綿羊的繁殖力候選基因的研究也有報(bào)道，何遠(yuǎn)清等[11]以RBP4為候選基因，檢測(cè) RBP4基因在高繁殖力綿羊品種（湖羊、小尾寒羊）和低繁殖力綿羊品種（薩福克羊、多賽特羊）中的單核苷酸多態(tài)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RBP4基因在4個(gè)綿羊品種中均存在多態(tài)性，且BB基因型小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)分別比AA和AB基因型多0.52只和0.67只。表明RBP4基因與小尾寒羊高繁殖力相關(guān)。在山羊種中，RBP4基因作為繁殖力候選基因尚未見報(bào)道，本研究對(duì)川中黑山羊RBP4基因編碼區(qū)進(jìn)行克隆，旨在為開展山羊RBP4基因的相關(guān)研究提供理論支持。

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RBP4基因作為綿羊的繁殖力候選基因的研究也有報(bào)道，何遠(yuǎn)清等[11]以RBP4為候選基因，檢測(cè) RBP4基因在高繁殖力綿羊品種（湖羊、小尾寒羊）和低繁殖力綿羊品種（薩?？搜?、多賽特羊）中的單核苷酸多態(tài)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RBP4基因在4個(gè)綿羊品種中均存在多態(tài)性，且BB基因型小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)分別比AA和AB基因型多0.52只和0.67只。表明RBP4基因與小尾寒羊高繁殖力相關(guān)。在山羊種中，RBP4基因作為繁殖力候選基因尚未見報(bào)道，本研究對(duì)川中黑山羊RBP4基因編碼區(qū)進(jìn)行克隆，旨在為開展山羊RBP4基因的相關(guān)研究提供理論支持。

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