趙 智，謝立群，羅俊卿，簡 明，劉 展

食管癌組織中CT10激酶調(diào)節(jié)子樣蛋白和細胞增殖核抗原Ki67的表達及其臨床意義

趙 智1，謝立群2，羅俊卿1，簡 明1，劉 展3

目的 探討食管癌組織中CT10激酶調(diào)節(jié)子樣蛋白(CT10 regulator of kinase like protein，CRKL)及細胞增殖核抗原Ki67的表達及與病理學特征的相關性。方法 采用免疫組化(SP)法，檢測60例食管癌組織及與其配對的56例正常癌旁組織中的CRKL及Ki67蛋白表達情況。結(jié)果 CRKL蛋白在食管癌中陽性表達率為56.7%(34/60)，明顯高于在正常癌旁組織的陽性表達率5.4%(3/56，P<0.01)；其表達與食管癌分化程度(P=0.027)、TMN分期(P=0.029)、浸潤深度(P=0.049)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 (P=0.012)有關，與患者年齡、性別、腫瘤大小、部位無關(P>0.05)。Ki67蛋白在食管癌中陽性表達率為68.3%(41/60)，明顯高于在正常癌旁組織的陽性表達率9.1%(5/56)(P<0.01)；其表達與腫瘤的TMN分期(P=0.006)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 (P=0.028) 有關，與患者年齡、性別、腫瘤大小、部位、分化程度、浸潤深度無關(P>0.05)。CRKL及Ki67蛋白在食管癌組織中的表達呈正相關(r=0.352，P=0.006)。結(jié)論 檢測CRKL及Ki67可判斷食管癌的惡性程度，CRKL可成為食管癌預后的臨床預測指標及分子治療的新靶點。

食管癌；CT10激酶調(diào)節(jié)子樣蛋白；細胞增殖核抗原Ki67；免疫組化SP法

食管癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率、病死率高，發(fā)病因素復雜[1]。尋找一種與食管癌惡性生物學行為密切相關的生物學標記物，對早期診治及預后判斷具有重要的臨床意義。CRKL蛋白是CRK信號接頭蛋白家族中的一員，能調(diào)節(jié)細胞內(nèi)、外蛋白與蛋白之間反應，參與多個信號通路的傳導[2]，與多種腫瘤有著重要關聯(lián)。Ki67蛋白是一種與細胞有絲分裂相關的蛋白質(zhì)，與細胞增殖密切相關，是反映腫瘤細胞增殖活性的公認標記物[3]，其高表達對于惡性腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及預后產(chǎn)生重要影響。本研究通過檢測食管癌組織中CRKL及Ki67的表達，并聯(lián)合臨床病理參數(shù)進行分析，探討其在食管癌發(fā)病、病情進展中的作用及相互之間關聯(lián)，為食管癌的診斷、治療及預后判斷提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象 收集武警湖南總隊醫(yī)院及湖南省人民醫(yī)院2013-03至2013-08胸外科手術切除的原發(fā)性食管癌組織60例及距腫瘤組織5 cm以上的正常食管組織56例，食管癌經(jīng)術后病理證實均為鱗狀細胞癌，其中男47例，女13例，年齡28～83歲，平均61.42歲。腫瘤位于食管上段12例，中段27例，下段21例。TMN分期：Ⅰ～Ⅱ期：24例，Ⅲ～Ⅳ期：36例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例。所有患者既往無自體免疫性疾病和其他腫瘤病史，術前未接受放、化療和免疫治療。

1.2 試劑和方法 羊抗兔CRKL抗體(C-20)購自美國Santa-cruz公司，產(chǎn)品貨號sc-319；羊抗兔Ki67抗體購自武漢博士德公司，產(chǎn)品貨號BA2888；DBA試劑盒購自武漢博士德公司。采用免疫組化(SP)法對切片染色，操作嚴格按照說明書進行。用0.01M PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性切片作為陽性對照。

1.3 結(jié)果判斷及評分標準 采用雙盲法，由2名高級職稱的病理醫(yī)師獨立閱片后判定。CRKL表達主要以細胞漿及極少量聯(lián)合有細胞核出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒為陽性，細胞漿或細胞核不著色或單一細胞核著色為陰性；Ki67表達以細胞核出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒為陽性，細胞核不著色或單一細胞漿著色為陰性。

評分標準：參考Kawasaki[4]的方法制定免疫組化半定量積分標準，即陽性細胞數(shù)所占百分率計分與染色強度的乘積來進行判斷。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS19.0軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，采用Spearman等級相關檢驗分析CRKL和Ki67的關聯(lián)狀況，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 CRKL和Ki67蛋白在食管癌及正常癌旁組織中的表達情況 CRKL蛋白大多表達于細胞漿，少量聯(lián)合細胞核表達(圖1)，食管癌中陽性表達率為56.7%(34/60)，正常癌旁組織陽性表達率為5.4%(3/56)，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；Ki67蛋白表達于細胞核(圖2)，在食管癌中陽性表達率為68.3%(41/60)，正常癌旁組織陽性表達率為9.1%(5/56)，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖1 CRKL蛋白在組織中的表達情況(SP，×200)

2.2 CRKL和Ki67與食管癌臨床病理參數(shù)的關系 CRKL的表達與食管癌分化程度(P=0.027)、TMN分期(P=0.029)、浸潤深度(P=0.049)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(P=0.012)，與患者年齡、性別、腫瘤大小、部位無關(P>0.05)。Ki67表達與腫瘤的TMN分期(P=0.006)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(P=0.028)，與患者年齡、性別、腫瘤大小、部位、分化程度、浸潤深度無關(P>0.05)。見表1。

圖2 Ki67蛋白在組織中的表達情況(SP，×200)

(n；%)

2.3 CRKL和Ki67在食管癌組織中表達的關系 CRKL蛋白的表達強度隨Ki67蛋白表達增強而升高，兩者存在正相關(r=0.352，P=0.006，表2)。

表2 食管癌組織CRKL與ki67蛋白表達的關系

3 討 論

信號傳導是將來自細胞外的信號刺激通過一定的機制轉(zhuǎn)換成細胞應答反應，引起細胞增殖、分化、代謝、應激、凋亡的過程等，從而可導致腫瘤的發(fā)生。CRKL蛋白是由定位于人染色體22q11.21的CRKL基因所編碼的一種信號接頭蛋白[5]，其本身不具有酶活性，但能與CBL 、HEF1 、CAS 、paxllin 、C3G 、SOS等結(jié)合，參與Ras，JNK， AR、Relinn、β整合素等信號通路。其功能包括：調(diào)節(jié)細胞增殖、黏附、運動、吞噬、分化、轉(zhuǎn)化和凋亡等[6]，在人類上皮組織中呈現(xiàn)微量表達。目前研究表明，基因突變及調(diào)節(jié)紊亂在白血病的發(fā)生中扮演著重要角色[7]，而CRKL與惡性腫瘤關系的最早研究，即開始于對白血病的研究，并且業(yè)已證實其與慢性髓性細胞白血病的發(fā)病及病情發(fā)展密切相關，并能作為病情預后的判斷指標[8]。Hiroko等[9]用全基因組的單核苷酸多態(tài)性基因芯片分析法(SNPs)、FISH法、免疫組化法檢測出胃癌細胞中CRKL基因和蛋白呈現(xiàn)高表達，指出CRKL基因擴增與蛋白的高表達有相關性，促進了胃癌的發(fā)生與發(fā)展，并且以CRKL蛋白為靶點可能對胃癌治療有幫助。WANG等[10]用免疫組化法和WB法檢測非小細胞肺癌中CRKL及Ki67表達情況，發(fā)現(xiàn) CRKL蛋白在非小細胞肺癌中明顯高表達，并且與Ki67蛋白呈正相關性而參與腫瘤細胞的增殖。另有研究表明，CRKL在頭頸部鱗狀細胞癌、膠質(zhì)母細胞瘤、前列腺癌、乳腺癌、橫紋肌肉瘤、卵巢癌等多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達，并且與腫瘤的分化、TMN分期、淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移等相關[11，12]。

Ki67蛋白的人類基因定位于染色體10q2.5，是增殖細胞中的一種核抗原[13]，其開始表達于細胞周期的G1期，在S期及G2期表達增加，至M期達到高峰，在G0期及G1早期無表達，是一種檢測腫瘤細胞活性的可靠指標。有研究表明，Ki67蛋白與膀胱癌、食管癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、頭頸部腫瘤等發(fā)病有關，可能與這些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、分期、浸潤、轉(zhuǎn)移、復發(fā)和預后等具有相關性[14，15]。

本研究運用SP法對60例食管癌及56例癌旁正常組織中的CRKL和Ki67蛋白進行檢測，發(fā)現(xiàn)CRKL主要在細胞質(zhì)中表達，其在食管癌組織中呈現(xiàn)高表達，與癌旁正常組織比較具有明顯差異；引入食管癌的臨床病理參數(shù)后的分析結(jié)果顯示，CRKL蛋白表達與食管癌的分化程度、TMN分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關，并且隨著腫瘤分化程度的降低、TMN分期的增高、浸潤深度的加深及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的增加而表達增強。同時發(fā)現(xiàn)Ki67蛋白僅表達于細胞核，在食管癌中也呈現(xiàn)高表達，與食管癌的TMN分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關，并隨腫瘤TMN分期增高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的增加而表達增強，和CRKL蛋白的相關性分析證實其與CRKL蛋白表達呈正相關。以上結(jié)果表明，CRKL與Ki67參與了食管癌的發(fā)生及發(fā)展過程，對其檢測可有助于判斷食管癌的惡性程度。并且，CRKL作為一種關鍵的信號傳導分子，參與了多種信號途徑并因此與許多腫瘤的形成與侵襲性有關，目前其具體的作用機制成為研究的熱點與難點。本研究通過檢測CRKL在食管癌中的表達情況，探討其與食管癌的關系，將有助于對其具體機制進行深入的研究，同時也為判斷食管癌發(fā)生、病情進展及臨床分子靶向治療提供了一種新的方向。

[1] Shangguo LIU，Xiuguang QIN， Baosheng ZHAO，etal. Differential expression of miRNAs in esophageal cancer tissue[J].Oncology Letters，2013，5(5):1639-1642.

[2] Feller S M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles[J]. Oncogene，2001，20(3):6348-6371.

[3] Gong P，Wang Y，Liu G，etal．New insight into Ki67 expression at the invasive front in breast cancer[J].PLoS One，2013，8(1):54912．

[4] Kawasaki H,Altieri D C,Lu C D,etal.Inhibition of a PoPtosis by surivin prediets shorter survial rates in colorectal cancer[J].Cancer Res,1998,58(22):5071-5074.

[5] Ten Hoeve J, Morris C, Heisterkamp N,etal. Isolation and chromosomal localization of CRKL, a human crk-like gene[J]. Oncogene，1993，8(9):2469-2474.

[6] Birge R B, Kalodimos C, Inagaki F,etal. Crk and CrkL adaptor proteins: networks for physiological and pathological signaling[J]. Cell Commun Signal，2009，7:13.

[7] 白雪玲，毛 霞，張 冰，等. CML28 在K562 細胞增殖與凋亡調(diào)控中的作用研究[J].武警醫(yī)學，2012，23(8)：678-681.

[8] Panigrahi S, Stetefeld J, Jangamreddy J R,etal. Modeling of Molecular Interaction between Apoptin, BCR-Abl and CrkL - An Alternative Approach to Conventional Rational Drug Design [J].PLoS One，2012，7(1):283-295.

[9] Hiroko Natsume, Kazuya Shinmura, Hong Tao,etal. The CRKL gene encoding an adaptor protein is amplified, overexpressed, and a possibletherapeutic target in gastric cancer[J].J Transl Med，2012， 10: 97.

[10] WANG Yan , FU Lin, WANG EN-Hua.Expression and significance of CRKL in human non-small-cell lung caner[J].Progress of Anatomical Sciences，2013，19(3): 225-228.

[11] Yanagi H, Wang L, Nishihara H,etal. CRKL plays a pivotal role in tumorigenesis of head and neck squamous cell carcinoma through the regulation of cell adhesion[J].Biochem Biophys Res Commun，2012，418(1):104-109.

[12] Reebye V, Bevan C L, Nohadani M,etal. Interaction between AR signalling and CRKL bypasses casodex inhibition in prostate cancer[J]. Cell Signal, 2010，22(12):1874-1881.

[13] Winking H，Gerdes J，Traut W．Expression of the proliferation marker Ki67 during early mouse development[J]．Cytogenet Genome Res，2004，105:251-256.

[14] Proctor I，Stoeber K，Williams G H.Biomarkers in bladder caner [J].His-topathOlogy，2010，57: 1-13．

[15] Werynska B，Pula B，Muszczynska-Bernhard B，etal． Correlation between expression of metallothionein and expression of Ki-67 and MCM-2 proliferation markers in non-small cell lung cancer[J]． Anticancer Res，2011，3(1): 2833-2839．

(2013-11-07收稿 2013-12-25修回)

(責任編輯 尤偉杰)

Expressions and clinical significances of CRKL and Ki67 in esophageal cancer

ZHAO Zhi1，XIE Liqun2，LUO Junqing1，JIAN Ming1，and LIU Zhan3.

1. Department of Gastroenterology, Hunan Provincal Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Changsha 410006, China，2.Department of Gastroenterology，Affiliated Hospital of Logistics University of Chinese People’s Armed Police Forces，Tianjin 300162，China，3.Department of Gastroenterology，Hunan Provincal People’s Hospital, Changsha 410008,China

Objective To study the expressions of CRKL and Ki67 proteins in esophageal cancer and the correlation between expression and clinicopathological features. Methods Immunohistochemistry streptavidin peroxidase (SP) was designed to detect the expression of CRKL and Ki67 proteins in 60 cases of esophageal cancer tissues and 56 cases of nomally adjacent tissues. Results The positive rate of CRKL protein expression in esophageal cancer tissues and nomal controls were 56.7%(34/60)and 5.4%(3/56), respectively; there was significant difference between them(P<0.01).The expression of CRKL protein in esophageal cancer had obvious correlations with degree of differentiation (P=0.027),TMN stages (P=0.029),depth of invasion (P=0.049)and lymphatic matastasis of tumor (P=0.012);and had no correlations with age and sex of patients,size and location of tumor(P>0.05).The positive rates of Ki67 protein in esophageal cancer tissues and nomal controls were 68.3%(41/60) and 9.1%(5/56),respectively;there was significant difference between them(P<0.01). The expression of Ki67 protein in esophageal cancer had obvious correlation with TMN stages (P=0.006)and lymphatic matastasis of tumor (P=0.028); and had no correlation with age,sex, degree of differentiation, depth of invasion,size and location of tumor(P>0.05).The expression of CRKL protein had positive correlation with the expression of Ki67 protein in esophageal cancer tissue(r=0.352，P<0.01). Conclusions CRKL and Ki67 participate in the development process of esophageal cancer and it is advantageous to judge the malignant degree of tumor by detecting their expressions. CRKL can be clinical predictors of esophageal cancer and newly molecular target of clinical treatment.

esophageal cancer；CRKL；Ki67；immunohistochemistry streptavidin peroxidase

趙 智，本科學歷，主治醫(yī)師，E-mail:zhaozjxk2012@163.com

1. 410006長沙，武警湖南總隊醫(yī)院內(nèi)二科；2. 300162天津，武警后勤學院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科；3. 410008長沙，湖南省人民醫(yī)院消化內(nèi)科

謝立群， E-mail: xieliqun66@hotmail.com

R735.1