楊 光，楊 宇，張玉杰，曾憲陽

蟾毒靈鎮(zhèn)痛作用及其作用機制探討

楊 光，楊 宇，張玉杰，曾憲陽

目的 研究蟾毒靈的鎮(zhèn)痛作用及其作用機制，為其臨床應用提供理論依據(jù)。方法 通過醋酸誘發(fā)小鼠扭體反應實驗和小鼠熱板實驗，研究蟾毒靈的鎮(zhèn)痛作用，通過Griess法和免疫印跡法研究RAW264.7細胞中NO含量和MAPK/p38/iNOS通路的變化。結果 蟾毒靈(0.5 mg/kg、1.0 mg/kg)可以劑量依賴性地減少醋酸所致的小鼠扭體數(shù)(P<0.05)，并可顯著提高熱板所致疼痛小鼠痛閾值(P<0.05)。體外研究表明蟾毒靈(0.04 μM, 0.08 μM)可顯著降低脂多糖(LPS)誘導的RAW264.7細胞的NO含量升高(P<0.05)，并可以抑制RAW264.7細胞的MAPK/p38/iNOS信號通路的激活。結論 蟾毒靈具有一定的鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛機制可能與抑制MAPK/p38/iNOS通路，繼而減少NO的合成和釋放有關。

蟾毒靈；鎮(zhèn)痛；一氧化氮；MAPK通路

蟾酥為蟾蜍科動物中華大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)和黑眶蟾蜍(Bufo melanost ictus Schneider)耳后腺的分泌物[1]。其性味甘辛、溫，有毒，具有解毒、消腫、醒神、開竅、強心和止痛等作用[2]。近年來對蟾酥及有效成分的研究表明，蟾毒靈(Bufalin)是發(fā)揮藥效的主要成分之一[3,4]。本研究針對蟾毒靈的鎮(zhèn)痛作用進行研究，并初步探討了其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與實驗動物 受試藥與動物分組 YLS-6B 智能熱板儀(山東省醫(yī)學科學院設備站)；多功能酶標儀(美國Biotek公司)。蟾毒靈(美國Sigma公司)；吲哚美辛腸溶片(江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司)。L-硝基精氨酸甲酯( L-NAME)，購自美國 Sigma 公司；NO試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。RAW264.7細胞購自中國科學院上海細胞庫。p38、phosphorate-p38、iNOS、β-actin抗體購自美國Cell Signaling公司。昆明種小白鼠40只(體重18～20 g，購自于中國醫(yī)科大學實驗動物中心)，隨機分為4組，每組10只，分別為空白對照組(給予相同體積的生理鹽水)，陽性對照吲哚美辛組(10 mg/kg，灌胃給藥)，蟾毒靈各劑量組(0.5 mg/kg、1.0 mg/kg，腹腔注射)。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠醋酸扭體法 4組小鼠給藥后1 h腹腔注射0.7%醋酸溶液0.2 ml/只。觀察并記錄15 min內出現(xiàn)扭體反應的次數(shù)，計算扭體抑制率。

扭體抑制率(%)=(空白對照組扭體均數(shù)-給藥組扭體均數(shù))/空白對照組扭體均數(shù)×100%[5]。

1.2.2 小鼠熱板法 將小鼠置于55 ℃的熱板上，以放置于熱板上至出現(xiàn)小鼠舔后足所需的時間(s)為該鼠的正常痛閾值。選擇正常痛閾值在5～30 s內的小鼠(喜跳躍的小鼠認為不合格)進行實驗。給藥前首先重復測定小鼠的正常痛閾值，取2次正常痛閾值的平均值為該小鼠的給藥前痛閾值，然后分別腹腔注射給藥，于給藥后30、60、90、120、150 min再測小鼠的痛閾值，若小鼠60 s內仍沒有出現(xiàn)舔后足的現(xiàn)象，則立即將小鼠取出，痛閾值按60 s計，并按照公式計算其痛閾提高百分率：

痛閾提高率(%)=(給藥后平均痛閾值-給藥前平均痛閾值)/給藥前平均痛閾值×100%[5]

1.2.3 NO的檢測 RAW264.7細胞按2×105/孔接種于96孔板中，每孔100 μl，貼壁4 h后，加入蟾毒靈(0.04 μM，0.08 μM)，正常對照孔或模型對照孔加入等體積的培養(yǎng)液，孵育2 h，再加入50 μl終濃度為10 μg/L的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激(正常對照孔加入等體積培養(yǎng)液)24 h，Griess法測定上清中NO的含量，用以反映NO水平。L-NAME(終濃度為200 μM)作為陽性對照藥物。

1.2.4 免疫印跡 實驗分4組：對照組、LPS組、蟾毒靈(0.04、0.08 μM)+ LPS組, 蟾毒靈預先加入RAW264.7細胞作用2 h，加入LPS 10μg/L作用24 h，棄去上清，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution ，PBS)洗滌2次，加入預冷的細胞裂解液，然后提取蛋白。蛋白定量后取20 μg蛋白質進行10%SDS-PAGE，轉PVDF膜后，用脫脂奶粉室溫封閉60 min，加入一抗過夜，然后二抗37 ℃孵育1 h。加入化學發(fā)光試劑(electrochemiluminescence， ECL)顯色液，置于凝膠成像儀中觀察并分析結果，CCD自動獲取圖像，同時小鼠β-actin作為內參照[6]。

方差分析判斷總體顯著性差異，組間資料采用LSD 或Games-Howell檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 扭體反應結果 蟾毒靈(0.5、1.0 mg/kg)給藥1 h后，可以劑量依賴性地減少醋酸所致的小鼠扭體數(shù)(P<0.05)，其中低劑量組的抑制率為30.8%，高劑量組的抑制率可達到48.0%。高劑量的鎮(zhèn)痛作用與陽性藥吲哚美辛(抑制率為51.4%)基本相當(表 1)。

表1 蟾毒靈對實驗小鼠扭體反應的影響 ±s)

注：與對照組相比,①P<0.05

2.2 熱板實驗結果 蟾毒靈(0.5、 1.0 mg/kg)給藥后30 min可以提高小鼠的痛閾值(P<0.05)，痛閾值提高百分率分別為38.3%和50%。90 min時達到峰值，痛閾值提高百分率分別為82.8%和117.7%。鎮(zhèn)痛效果持續(xù)到給藥后120 min，痛閾值提高百分率分別為46.4%和83.3%(表2)。與陽性藥吲哚美辛比，其強度稍弱，但作用維持時間長。結果提示，蟾毒靈對熱板所致疼痛鎮(zhèn)痛作用強。

表2 蟾毒靈給藥前、后不同時間對實驗小鼠痛閾值的影響 ±s)

注：與對照組比較,①P<0.05

2.3 蟾毒靈對巨噬細胞RAW264.7細胞NO釋放的影響 在10 μg/L的LPS刺激下，RAW264.7細胞釋放NO的量增加,與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明LPS能明顯誘導RAW264.7細胞釋放NO，而蟾毒靈對激活狀態(tài)RAW264.7細胞NO釋放有抑制作用，并呈良好的劑量依賴關系(表3)。

表3 蟾毒靈對RAW264.7細胞一氧化氮(NO)釋放的影響 ；μM)

注：與對照組比較①P<0.05; 與LPS組比較,②P<0.05

2.4 對巨噬細胞RAW264.7細胞MAPK/p38/iNOS通路的影響 在10 μg/L的LPS刺激下，RAW264.7細胞p38磷酸化增加，iNOS表達上調，表明LPS能激活RAW264.7細胞MAPK/p38/iNOS通路，加入蟾毒靈后可以劑量依賴性的抑制p38激活，并下調iNOS的表達水平。蟾毒靈對激活MAPK/p38/iNOS通路有抑制作用，并呈劑量依賴關系(圖1)。

圖1 蟾毒靈對RAW264.7細胞MAPK/p38/iNOS

3 討 論

蟾毒靈是從蟾酥中分離得到的活性較高的單體成分，近年來報道顯示其具有顯著的抗腫瘤活性作用[2,3]。有報道蟾毒靈能夠顯著抑制醋酸引起的小鼠扭體次數(shù)，還可明顯延長熱刺激所致小鼠痛覺反應時間，這說明蟾毒靈具有一定的鎮(zhèn)痛作用[4]。然而，目前對其鎮(zhèn)痛機制至今還不是很清楚。

醋酸扭體法和熱板法是兩個經(jīng)典的評價鎮(zhèn)痛藥效果的實驗方法。本研究采用兩種方法，對不同劑量的蟾毒靈進行了鎮(zhèn)痛藥效評價，以期進一步證明蟾毒靈的鎮(zhèn)痛藥理效果。醋酸扭體實驗結果顯示，蟾毒靈給藥后，可以劑量依賴性的減少醋酸所致的小鼠扭體數(shù)，高劑量的鎮(zhèn)痛作用與陽性藥吲哚美辛基本相當。熱板實驗結果顯示，蟾毒靈給藥后短時間內即可提高小鼠的痛閾值，鎮(zhèn)痛效果持續(xù)到給藥后120 min，與陽性藥吲哚美辛比其強度稍弱，但作用維持時間長。本研究結果提示蟾毒靈具有良好的鎮(zhèn)痛作用，且具有作用維持時間長的藥理特點。

NO是一種重要的信息傳遞物質和神經(jīng)遞質，近年來的研究表明NO參與痛覺調制，并可促進疼痛傳入和致痛介質的釋放，同時還可以促進脊髓痛覺過敏形成和腦內痛覺信息的加工[7-9]。本研究結果還發(fā)現(xiàn)，蟾毒靈可以劑量依賴性的抑制LPS誘導的NO釋放，這就提示蟾毒靈可能通過抑制NO的釋放，達到抑制疼痛傳入和致痛介質的釋放過程，繼而減輕疼痛癥狀。MAPK/p38信號通路是細胞內重要的信號通路，除了參與細胞的增殖、分化外，還參與炎性遞質的釋放，而細胞內負責合成NO的誘導性一氧化氮合酶(iNOS)就是其重要的靶基因[10,11]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，炎性介導物質LPS可以誘導MAPK/p38信號通路激活，繼而促進iNOS表達增加。而蟾毒靈可以劑量依賴性的抑制LPS誘導的p38磷酸化及iNOS的表達，這說明抑制MAPK/p38通路可能是蟾毒靈減輕疼痛作用的上游靶點。

綜上所述，可以發(fā)現(xiàn)蟾毒靈對兩種不同的致痛方法誘發(fā)的疼痛均有較強的鎮(zhèn)痛作用，表明其鎮(zhèn)痛機制是多方面的，可能與抑制MAPK/p38/iNOS通路，繼而抑制NO釋放相關，但其確切的鎮(zhèn)痛機制有待進一步研究。

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(2013-10-11收稿 2013-12-20修回)

(責任編輯 郭 青)

A study on analgesic effect of bufalin and its underlying mechanisms

YANG Guang，YANG Yu，ZHANG Yujie, and ZENG Xianyang.

Department of Anesthesiology ,Liaoning Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces. Shenyang 110034, China

Objective To investigate the analgesic effect of bufalin and its underlying mechanisms. Methods The analgesic effect of bufalin was studied by the acetic acid-induced writhing response and hot plate test. The contents of NO and the activation of MAPK/p38/iNOS pathway in LPS-induced RAW264.3 were measured by Griess assay and Western blotting, respectively. Results Bufalin (0.5， 1.0 mg/kg) showed a significant inhibition of acetic acid-induced writhing response and prolonging of licking time in hot plate test at a dose-dependent manner (P<0.05). Bufalin (0.04, 0.08 μM) significantly reduced the contents of NO and inhibited the activation of MAPK/p38/iNOS in RAW264.7 cells. Conclusions The analgesic of bufalin is related to suppressing the activation of MAPK/p38/iNOS pathway and subsequently reducing the synthesis and releases of excessive NO.

bufalin；analgesia；NO；MAPK pathway

楊 光，本科學歷，主任醫(yī)師，E-mail: 2000volare@sina.com

110034沈陽，武警遼寧總隊醫(yī)院麻醉科

楊 宇，E-mail: 2000volare@sina.com

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