高曉嶙，白云飛，王若晗，張曉蘭

肱二頭肌長(zhǎng)頭肌腱過(guò)度使用中相關(guān)生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)規(guī)律的研究

高曉嶙1,2，白云飛3，王若晗2，張曉蘭2

為研究生長(zhǎng)因子在過(guò)度使用導(dǎo)致肌腱退行性變中的作用機(jī)制，利用SD大鼠8周下坡跑模型造成肱二頭肌長(zhǎng)頭肌腱結(jié)節(jié)溝段退行性變，采用免疫組織化學(xué)等方法，檢測(cè)運(yùn)動(dòng)各階段肌腱IGF1、TGFβ1、 BMP12 、bFGF蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果：在肱二頭肌長(zhǎng)頭整體肌腱中，只有bFGF表達(dá)顯著增加；bFGF在過(guò)度使用第2周顯著升高(P<0.01)，第4周下降，第6周(P<0.05)和第8周(P<0.01)再次持續(xù)升高。在肱二頭肌長(zhǎng)頭肌腱結(jié)節(jié)溝段，IGF1表達(dá)無(wú)顯著變化，TGFβ1 、bFGF、 BMP12表達(dá)均顯著增高；TGFβ1表達(dá)逐漸升高，第6周達(dá)到高峰(P<0.05)，第8周迅速下降；bFGF 表達(dá)在第4周迅速升高到峰值(P<0.01)，然后下降，到第8周與對(duì)照組無(wú)顯著差異；BMP12蛋白表達(dá)逐漸增加，第6周達(dá)到高峰(P<0.05)，第8周略下降。結(jié)論：肌腱過(guò)度使用中相關(guān)生長(zhǎng)因子蛋白長(zhǎng)期異常表達(dá)是肌腱退行性變的重要病理變化，有可能推動(dòng)了肌腱退行性變的進(jìn)程。

過(guò)度使用；肌腱；退行性變；生長(zhǎng)因子

生長(zhǎng)因子在調(diào)節(jié)肌腱細(xì)胞功能，基質(zhì)代謝，肌腱干細(xì)胞增殖、分化等方面具有重要的功能，在肌腱損傷修復(fù)、退行性變等病理過(guò)程中也具有重要作用。有研究[14,7]顯示，肌腱退行性變組織中部分生長(zhǎng)因子基因高表達(dá)，且肌腱細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子反應(yīng)異常，并據(jù)此推測(cè)在過(guò)度使用導(dǎo)致反復(fù)損傷積累過(guò)程中，肌腱組織有可能受到長(zhǎng)期生長(zhǎng)因子的異常作用，引起肌腱細(xì)胞功能異常，導(dǎo)致肌腱發(fā)生退變。本研究擬通過(guò)建立肌腱過(guò)度使用動(dòng)物模型，檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)變化，綜合探討過(guò)度使用中相關(guān)細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)規(guī)律在肌腱退行性變中的作用機(jī)制，為揭示肌腱退行性變的病理機(jī)制提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新思路。

1 研究材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠50只(維通利華公司提供)，兩月齡，體重250.4±8.6 g。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，自由飲食。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫18±2℃，光照時(shí)間12 h，相對(duì)濕度40%～55%。大鼠隨機(jī)分為5組：對(duì)照組、2周組、4周組、6周組、8周組，每組10只SD大鼠。各組大鼠初始體重?zé)o顯著性差異(P>0.05)。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

對(duì)照組大鼠籠中自由活動(dòng)；2周組大鼠進(jìn)行2周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練；4周組大鼠進(jìn)行4周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練；6周組大鼠進(jìn)行6周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練；8周組大鼠進(jìn)行8周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。采用跑臺(tái)(中國(guó)杭州段式制作DSPY0202)建立下坡跑肱二頭肌肌腱過(guò)度使用模型[2,6,16]。2、4、6、8周組大鼠先開始4天適應(yīng)性訓(xùn)練(10°下坡跑，速度17～20 m/min，15 min/d)，然后開始正式訓(xùn)練(10°下坡跑，速度20～25 m/min，1.5 h/d，每周運(yùn)動(dòng)6天，休息1天)。

1.3 取材、切片與HE染色

對(duì)照組大鼠與8周組大鼠一起處死，取肌腱。2、4、6、8周組大鼠分別于最后一次運(yùn)動(dòng)結(jié)束24 h后處死，左側(cè)取肱二頭肌長(zhǎng)頭肌腱結(jié)節(jié)間溝部位，生理鹽水沖洗，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，沿縱軸切片，厚度0.3 μm。蘇木素伊紅染色(HE)，光鏡(10×20)觀察肌腱損傷情況。右側(cè)取肱二頭肌長(zhǎng)頭肌腱全長(zhǎng)，生理鹽水沖洗，液氮固定，-70℃保存，以備ELASA和Westen blot檢測(cè)用。1.4 免疫組化染色

采用免疫組化S-P法,第一抗體采用兔多克隆BMP12抗體(Ab92756)、兔多克隆bFGF抗體(Ab106245)、兔多克隆TGFβ1抗體(Ab31013)、兔多克隆IGF1抗體(Ab39398)。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，陽(yáng)性免疫復(fù)合物為棕色。光鏡觀察，放大倍數(shù)為400倍(10×40)。每個(gè)樣本隨機(jī)選3張切片，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行分析。

1.5 ELASA與Westen Blot

用濾紙吸干肱二頭肌肌腱組織液和血液，稱重肌腱組織，加入5倍PBS溶液，玻璃勻漿器勻漿3 min，置于冰上5 min，重復(fù)5次，至勻漿徹底。3 500 rpm離心10 min，取上清液。沉淀組織再次加5倍PBS溶液，玻璃勻漿器勻漿3 min，置于冰上5 min，重復(fù)5次，至勻漿徹底。3 500 rpm離心10 min，取上清液,合并兩次上清液備用。采用Abcam公司ELASA試劑盒檢測(cè)右側(cè)肌腱bFGF、 TGFβ1、IGF1蛋白表達(dá)；Westen Blot法檢測(cè)右側(cè)肌腱BMP12蛋白表達(dá)，一抗為兔多克隆BMP12抗體(Ab92756)。

1.6 圖像分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)免疫組化切片和Westen Blot電泳條帶的平均光密度(MOD)值進(jìn)行測(cè)定，以MOD值的變化反映蛋白表達(dá)量的相對(duì)變化。采用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用One-Way ANOVA方差分析總體蛋白表達(dá)差異，組間兩兩比較采用Bonferroni.法檢驗(yàn)，結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05為顯著性水平，P<0.01為非常顯著性水平。

2 結(jié)果

2.1 肱二頭肌長(zhǎng)頭肌腱結(jié)節(jié)間溝段組織病理

HE染色發(fā)現(xiàn)對(duì)照組肌腱結(jié)構(gòu)正常，膠原纖維排列緊密、相互平行，著色正常；肌腱細(xì)胞核呈梭形或紡錘形，均勻排列在膠原纖維之間。從2周組開始出現(xiàn)膠原纖維結(jié)構(gòu)和排列逐漸紊亂；4周組出現(xiàn)膠原纖維著色變淺或不均勻，部分肌腱細(xì)胞核向圓形轉(zhuǎn)變，排列逐漸紊亂；6周組出現(xiàn)膠原纖維斷裂，肌腱膠原纖維結(jié)構(gòu)和排列更加紊亂，圓形細(xì)胞核比例增多，細(xì)胞外基質(zhì)比例逐漸增多；8周組細(xì)胞分布更加不均，進(jìn)一步出現(xiàn)局灶性細(xì)胞聚集。各組沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯血管增生和透明樣變性，也未見(jiàn)炎癥細(xì)胞(圖1)。

圖 1 各組切片HE染色結(jié)果(200×)

2.2 生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)

2.2.1 肱二頭肌長(zhǎng)頭肌腱結(jié)節(jié)溝段

采用單因素方差分析檢驗(yàn)對(duì)照組與各運(yùn)動(dòng)組的肱二頭肌長(zhǎng)頭肌腱結(jié)節(jié)溝段生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGFβ1(P<0.05)、FGF(P<0.01)、BMP12(P<0.05)3個(gè)因子的蛋白表達(dá)有顯著性差異。

IGF1蛋白表達(dá)的MOD在各組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；TGFβ1蛋白表達(dá)MOD值呈逐漸升高趨勢(shì)，到第6周達(dá)到高峰，第8周出現(xiàn)顯著下降；bFGF蛋白表達(dá)的MOD在第4周明顯升高，之后又逐漸下降，第8周重新降到對(duì)照組水平。BMP12蛋白表達(dá)MOD逐漸增加，第6周升高明顯，第8周又略有下降(圖2)。

2.2.2 肱二頭肌長(zhǎng)頭肌腱整體生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)

采用單因素方差分析檢驗(yàn)對(duì)照組與過(guò)度使用各組肱二頭肌長(zhǎng)頭肌腱整體的生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，bFGF蛋白濃度在各組之間有顯著性差異(P<0.01)。

表 1 本研究肱二頭肌長(zhǎng)頭肌腱結(jié)節(jié)溝段生長(zhǎng)

表 2 本研究各組肱二頭肌長(zhǎng)頭肌腱結(jié)節(jié)溝部位生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)(MOD)比較一覽表

圖 2 本研究過(guò)度使用中肱二頭肌長(zhǎng)頭肌腱結(jié)

各組肌腱整體IGF1 、TGFβ1 和BMP12蛋白表達(dá)未發(fā)現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)。IGF1平均濃度在207.86～297.93 pg/ml之間；TGFβ1平均濃度在192.35～259.88

pg/ml之間。隨著過(guò)度使用進(jìn)行，第2周肌腱整體bFGF濃度出現(xiàn)顯著升高，第4周下降，然后再次升高；2周組、8周組與對(duì)照組之間差異具有高度顯著性(P<0.01)；6周組與對(duì)照組之間差異具有顯著性(P<0.05)。bFGF平均濃度變化范圍為91.41～134.23 pg/ml。

表 3 本研究肱二頭肌長(zhǎng)頭肌腱整體生長(zhǎng)

表 4 本研究各組肱二頭肌長(zhǎng)頭肌腱整體生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)比較一覽表

3 討論

目前，有關(guān)腱病中的病理特征已經(jīng)確定[11]，主要為肌腱退行性變，如膠原纖維排列紊亂，失去正常的緊密平行排列的結(jié)構(gòu)，甚至出現(xiàn)粘液樣變性或透明樣變性；腱細(xì)胞梭形外觀消失，核變圓形，細(xì)胞外基質(zhì)增多，可見(jiàn)局灶性細(xì)胞增多，沒(méi)有炎癥細(xì)胞；肌腱內(nèi)可伴有不規(guī)則血管增生。本研究采用前人研究[2,6,16]建立的SD大鼠肱二頭肌過(guò)度使用模型，切片顯示，肱二頭肌長(zhǎng)頭肌腱結(jié)節(jié)溝段從運(yùn)動(dòng)后第2周就出現(xiàn)了部分肌腱退行性變，如膠原纖維排列紊亂等，并且逐漸加重，相繼發(fā)生膠原纖維淡染、細(xì)胞核變圓、細(xì)胞分布不均、纖維斷裂等，結(jié)果證實(shí)肱二頭肌過(guò)度使用模型建立成功。

肌腱具有很強(qiáng)的耐壓、抗張力和抗摩擦的能力。力學(xué)刺激會(huì)對(duì)肌腱細(xì)胞表面的牽張受體和黏附位點(diǎn)產(chǎn)生很大作用，導(dǎo)致一系列生物效應(yīng)的瀑布效應(yīng)[4]。有研究[12]顯示，周期性張力刺激可以提高許多生長(zhǎng)因子表達(dá)，提示適宜的運(yùn)動(dòng)可以通過(guò)生長(zhǎng)因子實(shí)現(xiàn)對(duì)肌腱的重塑。然而，在過(guò)度使用中是否也存在相關(guān)生長(zhǎng)因子的高表達(dá)，其變化規(guī)律，是否在肌腱退行性變中發(fā)揮了作用還很少有報(bào)道。

本研究顯示，過(guò)度使用過(guò)程中肱二頭肌長(zhǎng)頭肌腱易損部位(結(jié)節(jié)溝段)與肌腱撕裂后愈合階段的生長(zhǎng)因子表達(dá)有明顯區(qū)別。許多研究顯示，肌腱斷裂修復(fù)時(shí)多數(shù)生長(zhǎng)因子表達(dá)升高相對(duì)較短，約在1周內(nèi)。例如：Würgler-Hauri等人[18]利用大鼠崗上肌腱斷裂修復(fù)術(shù)模型發(fā)現(xiàn)，bFGF、BMP12、BMP 13、BMP14、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)，血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、TGFβ1在損傷后1周蛋白表達(dá)增高，然后迅速下降恢復(fù)到對(duì)照組水平。Heisterbach 等人[9]研究也發(fā)現(xiàn)，大鼠跟腱斷裂后bFGF、 BMP12 和VEGF表達(dá)升高1周，然后bFGF、 BMP12迅速下降，而VEGF表達(dá)持續(xù)保持較高水平。陳亮等人[1]研究大鼠跟腱損傷部位修復(fù)過(guò)程中生長(zhǎng)因子基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IGF-1、bFGF、BMP12、TGFβ1等大部分生長(zhǎng)因子在肌腱損傷早期(1周內(nèi))高表達(dá)，然后迅速下降。這些肌腱斷裂修復(fù)研究結(jié)果表明，生長(zhǎng)因子高表達(dá)在早期肌腱修復(fù)中起重要作用，但后期并不需要。本研究結(jié)果顯示，過(guò)度使用過(guò)程中局部易損部位相關(guān)生長(zhǎng)因子增高表達(dá)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，大于2周，高峰期多數(shù)在第4～6周，且變化不一致，相對(duì)較亂。

從生理學(xué)來(lái)看，肌腱修復(fù)的相關(guān)生長(zhǎng)因子作用復(fù)雜，且相互影響，對(duì)肌腱的生物學(xué)效應(yīng)與劑量，細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境有密切關(guān)系，所以，長(zhǎng)期高表達(dá)也許不一定有利于肌腱修復(fù)。例如，Nielsen研究[15]發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期過(guò)高/過(guò)低血漿IGF水平都會(huì)導(dǎo)致小鼠肌腱膠原纖維直徑顯著下降；Liu等人研究[13]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性IGF1和BMP2能促進(jìn)PEG2誘導(dǎo)的肌腱干細(xì)胞脂肪分化；Bell等人[8]證實(shí)通過(guò)注射TGFβ1，可以造成跟腱退行性變化；Jiang等[10]研究結(jié)果提示，TGFβ1在腱病中I膠原合成與推動(dòng)細(xì)胞凋亡上可能扮演重要角色；體外培養(yǎng)研究[5]顯示，大劑量(30～50 μg/l)bFGF對(duì)肌腱細(xì)胞增殖和基因表達(dá)均有強(qiáng)烈抑制作用；Tang等人研究[17]還提示，bFGF的變化可能影響TGFβ1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子(scleraxis)、胰島素樣生長(zhǎng)因子的表達(dá)。我們推測(cè)肌腱斷裂修復(fù)時(shí)生長(zhǎng)因子的協(xié)同變化可能促進(jìn)了肌腱愈合過(guò)程，而過(guò)度使用中長(zhǎng)期雜亂生長(zhǎng)因子表達(dá)有可能不利于肌腱修復(fù)，甚至可能導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂、干細(xì)胞錯(cuò)誤分化、基質(zhì)代謝紊亂，推動(dòng)肌腱退行性變的病理進(jìn)程。

此外，本研究結(jié)果還顯示，過(guò)度使用中肱二頭肌長(zhǎng)頭肌腱整體與局部易損部位的生長(zhǎng)因子表達(dá)規(guī)律不一致。肌腱整體只有bFGF蛋白表達(dá)顯著增加，第2周顯著升高，第4周下降，第6周和第8周再次顯著升高；IGF1、TGFβ1、BMP12都沒(méi)有顯著性變化。結(jié)節(jié)溝段肌腱TGFβ1表達(dá)逐漸增高，到第6周最為顯著，第8周有迅速下降；bFGF表達(dá)在第4周迅速升高到峰值，然后，又迅速下降，第8周與對(duì)照組無(wú)顯著差異；BMP12蛋白表達(dá)逐漸增加，在第6周達(dá)到高峰，第8周又略有下降。IGF1在整個(gè)8周運(yùn)動(dòng)過(guò)程中都沒(méi)有出現(xiàn)顯著性變化。肱二頭肌長(zhǎng)頭肌腱結(jié)節(jié)溝部位是臨床腱病好發(fā)部位，長(zhǎng)期承受著比周圍肌腱更高的機(jī)械負(fù)荷刺激。本研究推測(cè)，正常情況下肌腱整體以bFGF 蛋白表達(dá)增高應(yīng)對(duì)下坡跑運(yùn)動(dòng)，提高肌腱修復(fù)能力，而肌腱結(jié)節(jié)溝部位因?yàn)槌惺芰碎L(zhǎng)期過(guò)度的機(jī)械刺激量與強(qiáng)度，導(dǎo)致了更多生長(zhǎng)因子長(zhǎng)期高表達(dá)，肌腱在這種長(zhǎng)期紊亂調(diào)節(jié)下，就可能會(huì)出現(xiàn)功能紊亂，向肌腱退行性變發(fā)展。肌腱整體與局部易損部位生長(zhǎng)因子表達(dá)差異的結(jié)果提示：生長(zhǎng)因子表達(dá)種類和出現(xiàn)順序可能與承受的機(jī)械負(fù)荷大小有關(guān)，長(zhǎng)期異常生長(zhǎng)因子高表達(dá)與肌腱退行性變有關(guān)，可能推進(jìn)了其病理進(jìn)程。本研究還顯示，IGF1蛋白表達(dá)在肌腱整體和易損部位都沒(méi)有發(fā)生明顯改變，提示并非所有的生長(zhǎng)因子在肌腱過(guò)度使用中都會(huì)發(fā)生表達(dá)變化。其他一些大鼠肌腱研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，如李敏等[3]在大鼠急性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后檢測(cè)跟腱中IGF1基因、蛋白表達(dá)，也未發(fā)現(xiàn)有明顯變化；Molloy等[14]檢測(cè)了大鼠崗上肌腱過(guò)度使用肌腱基因表達(dá)譜，同樣沒(méi)有發(fā)現(xiàn)IGF1基因表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)/下調(diào)變化。

4 小結(jié)

在肌腱過(guò)度使用中，肱二頭肌長(zhǎng)頭肌腱整體與局部易損部位的生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)規(guī)律不一致；局部易損部位相關(guān)生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)變化較亂，并非所有生長(zhǎng)因子都出現(xiàn)變化，與肌腱斷裂修復(fù)有明顯區(qū)別；肌腱過(guò)度使用中相關(guān)生長(zhǎng)因子蛋白長(zhǎng)期異常表達(dá)是肌腱退行性變的重要病理變化，有可能推動(dòng)了肌腱退行性變的進(jìn)程。

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StudyonGrowthFactorsProteinExpressionCharacteristicsinTendonofLongHeadofBicepsBrachiiduringOveruseProcess

GAO Xiao-lin1,2,BAI Yun-fei3,WANG Ruo-han2,ZHANG Xiao-lan2

Objective:This experlment was dessgned to study the role of growth factors in tendon degeneration overuse-induced.Methods:This study established the rats tendon overused model by downhill running,detected growth factors gene expression in various stages of overuse by immunohistochemistry.Results:In whole tendon,bFGF protein expression was significantly increased during the downhill running,but TGFβ1,bFGF and BMP12 had no significantly change.bFGF was significantly increased at 2 weeks (P<0.01),decreased at 4 weeks,and raised again at 6-8 weeks.In rat biceps brachii tendon intertubercular sulcus parts,IGF1 expression had no significantly change,but expression of TGF β1,bFGF,and BMP12 were significantly increased.The expression of TGF β1 increased gradually,reached a peak at 6 weeks (P<0.05),decreased rapidly at 8weeks.The expression of bFGF reached the peak at 4 weeks value (P<0.01),and then decreased at 8 weeks.The expression of BMP12 protein increased gradually,reached a peak at 6 weeks (P<0.05),and declined slightly at 8 weeks.Conclusion:During overuse process,long-term abnormal expression of growth factors was an important pathological chang of tendon degeneration,which probably pushed the tendon degeneration process.

overuse;tendon;degeneration;growthfactor

1000-677X(2014)09-0044-05

2014-03-20；

：2014-08-06

高曉嶙(1974-)，男，安徽人，副研究員，博士，研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)損傷預(yù)防與康復(fù)，Tel：(010)87182525，E-mail：gao321452@sina.com。

1.國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所，北京 100061；2. 北京體育大學(xué)，北京100084；3.國(guó)家體育總局運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所 體育醫(yī)院，北京 100061 1.China Institute of Sport Science,Beijing 100061，China;2.Beijing Sports University,Beijing 100084.China;3.National Research Institute of Sports Medicine,Beijing 100061,China.

G804.7

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