邢保山，郭瓊，張玨，郭立新，金仁村

杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036

保藏溫度對(duì)厭氧氨氧化顆粒污泥特性的影響

邢保山，郭瓊，張玨，郭立新，金仁村

杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036

邢保山, 郭瓊, 張玨, 等. 保藏溫度對(duì)厭氧氨氧化顆粒污泥特性的影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(12): 1876?1888.

Xing BS, Guo Q, Zhang J, et al. Influence of preservation temperature on the characteristics of anammox granular sludge. Chin J Biotech, 2014, 30(12): 1876?1888.

為考察保藏溫度對(duì)厭氧氨氧化污泥顆粒特性的影響，同時(shí)優(yōu)化保藏厭氧氨氧化顆粒污泥溫度參數(shù)，本試驗(yàn)首先通過(guò)HRT調(diào)控進(jìn)水基質(zhì)負(fù)荷培養(yǎng)厭氧氨氧化顆粒污泥，并采用KHCO3和NaHCO3交替提供無(wú)機(jī)碳源。然后分別在–40 ℃、4 ℃、(27±4) ℃室溫和35 ℃條件下避光保藏。結(jié)果表明，NaHCO3可代替KHCO3作為厭氧氨氧化菌生長(zhǎng)的無(wú)機(jī)碳源。相比于其他保藏溫度，4 ℃保藏能夠較好地維持生物量和生物活性，同時(shí)能較好地維持顆粒污泥的沉降性能、顆粒污泥和細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性。在保藏過(guò)程中，一階衰減指數(shù)模型可擬合厭氧氨氧化顆粒污泥生物量及活性的衰減過(guò)程，衰減指數(shù)與胞溶程度正相關(guān)，而且生物量的衰減比活性的衰減更快。同時(shí)，顆粒污泥胞外聚合物中蛋白質(zhì)與多糖的比值 (PN/PS) 和血紅素不能有效指示保藏過(guò)程中顆粒污泥沉降性能和活性的變化，而生物活性與胞溶程度呈負(fù)相關(guān)。

厭氧氨氧化，顆粒污泥，保藏溫度，顆粒特性

厭氧氨氧化是一種新型生物脫氮工藝，能夠在厭氧條件下以亞硝酸鹽為電子受體將氨氮氧化為氮?dú)?，?shí)現(xiàn)兩種氮素污染物的同時(shí)脫除[1-2]。相比于傳統(tǒng)生物脫氮工藝，厭氧氨氧化具有脫氮效果好、無(wú)需外加有機(jī)碳源、運(yùn)行成本低等優(yōu)點(diǎn)，工業(yè)應(yīng)用前景廣闊。然而，厭氧氨氧化菌 (AnAOB) 倍增時(shí)間長(zhǎng)，致使厭氧氨氧化工藝啟動(dòng)時(shí)間較長(zhǎng)，不利于其工業(yè)化應(yīng)用[1,3]。有關(guān)研究表明，部分或全部接種厭氧氨氧化污泥能夠快速啟動(dòng)厭氧氨氧化工藝[4]。同時(shí)，采取厭氧氨氧化污泥流加方式能夠顯著減小低溫、有機(jī)物和有毒物質(zhì)等對(duì)厭氧氨氧化工藝運(yùn)行的干擾[5-6]。此外，在實(shí)際運(yùn)行中，某些工業(yè)廢水來(lái)源的季節(jié)性可能導(dǎo)致厭氧氨氧化工藝暫停運(yùn)作。在上述操作過(guò)程中，厭氧氨氧化污泥的保藏是不可回避的技術(shù)問(wèn)題。

厭氧氨氧化顆粒污泥具有良好的沉降性能，有利于菌體的大量持留，同時(shí)具有較高的密度、機(jī)械強(qiáng)度以及耐負(fù)荷沖擊能力，使其成為厭氧氨氧化污泥最佳的存在形態(tài)之一。顆粒污泥的生物量及其活性共同決定工藝脫氮能力，顆粒粒徑影響傳質(zhì)及沉降性能，同時(shí)胞外聚合物 (EPS) 影響顆粒污泥對(duì)逆境的耐受能力。因此，維持保藏期污泥的顆粒特性是優(yōu)選保藏條件的重要標(biāo)準(zhǔn)。在無(wú)基質(zhì)供給的條件下，較高溫度時(shí)微生物衰減速率快，不利于微生物的長(zhǎng)期保藏；較低溫度可減緩微生物衰減速率，然而溫度過(guò)低有可能破壞微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，不利于微生物活性的恢復(fù)。因此，選擇適宜的保藏溫度對(duì)于微生物資源開(kāi)發(fā)利用尤為關(guān)鍵。不同保藏溫度對(duì)厭氧氨氧化絮狀污泥活性的影響已有報(bào)道[7-8]，然而，有關(guān)保藏溫度對(duì)厭氧氨氧化顆粒污泥特性的影響鮮見(jiàn)較為系統(tǒng)的研究報(bào)道。Adav等[9]指出?20 ℃適宜維持好氧顆粒污泥沉降性能及其活性。Gao等[10]研究表明保藏溫度對(duì)好氧顆粒污泥的形態(tài)結(jié)構(gòu)及其理化特性影響較大；其中，4 ℃保藏更有利于顆粒污泥結(jié)構(gòu)的維持；?25 ℃保藏顆粒污泥沉降性能最優(yōu)，且PN與PS的比值 (PN/PS) 無(wú)明顯變化。Vlaeminck等[11]探究了不同溫度條件下限氧自養(yǎng)硝化?反硝化 (OLAND) 工藝中污泥長(zhǎng)期保藏后重激活過(guò)程，結(jié)果表明4 ℃保藏約5個(gè)月后，AnAOB的活性降為保藏起始值的55%。Rothrock等[12]對(duì)比研究了有無(wú)甘油添加時(shí)?60℃和–200 ℃條件下，AnAOB冷凍保藏4個(gè)月后重激活過(guò)程，結(jié)果表明–200 ℃無(wú)甘油添加重激活后AnAOB的化學(xué)計(jì)量比與種子反應(yīng)器最為接近。Heylen等[13]在–80 ℃條件下通過(guò)添加不同劑量的保護(hù)劑 (如海藻糖、二甲亞砜和甘油)，探究了AnAOB單細(xì)胞和顆粒污泥低溫保藏的可行性。Ali等[14]分別在?80 ℃、4 ℃和室溫條件下，研究了厭氧氨氧化污泥活性的變化，認(rèn)為在實(shí)際工業(yè)應(yīng)用中室溫條件下添加鉬酸鹽是最簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)有效的保藏方法。汪彩華等[15]重點(diǎn)探討了溫度和基質(zhì)種類對(duì)厭氧氨氧化菌混培物生化性狀 (如EPS、血紅素和硫含量) 和形態(tài)結(jié)構(gòu)(如粒徑、顏色和菌體結(jié)構(gòu)) 的影響。

本文系統(tǒng)研究保藏溫度對(duì)厭氧氨氧化顆粒污泥特性的影響，以期優(yōu)選保藏溫度，為厭氧氨氧化顆粒污泥菌種資源庫(kù)的構(gòu)建奠定理論基礎(chǔ)，進(jìn)而為厭氧氨氧化工藝的工業(yè)化應(yīng)用提供菌源保障。

1 材料與方法

1.1 接種污泥和模擬廢水

本試驗(yàn)接種污泥為實(shí)驗(yàn)室厭氧氨氧化反應(yīng)器流失污泥，接種后反應(yīng)器內(nèi)污泥濃度 (SS) 和揮發(fā)性污泥濃度 (VSS) 分別為36.3 g/L和22.9 g/L。反應(yīng)器進(jìn)水為無(wú)機(jī)模擬廢水，其組成為：(NH4)2SO4和NaNO2(按需添加)，NaH2PO410 mg/L，CaCl2·2H2O 5.6 mg/L，MgSO4·7H2O 300 mg/L，KHCO31 250 mg/L (或NaHCO31 049 mg/L)，微量元素濃縮液Ⅰ、Ⅱ各1.25 mL/L。其中，微量元素濃縮液Ⅰ的組成為EDTA 5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 9.14 g/L；濃縮液Ⅱ的組成為EDTA 15 g/L，H3BO40.014 g/L，MnCl2·4H2O 0.99 g/L，CuSO4·5H2O 0.25 g/L，ZnSO4·7H2O 0.43 g/L，NiCl2·6H2O 0.21 g/L，NaMoO4·2H2O 0.22 g/L，CoCl2·6H2O 0.24 g/L。

1.2 試驗(yàn)裝置和試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)首先采用實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的UASB反應(yīng)器(有效體積為2.5 L) 培養(yǎng)厭氧氨氧化顆粒污泥，經(jīng)過(guò)346 d培養(yǎng)后采用4個(gè)具塞玻璃瓶進(jìn)行厭氧氨氧化顆粒污泥保藏試驗(yàn) (圖1)。將待保藏顆粒污泥混合均勻，分別取300 mL至具塞玻璃瓶中，用氬氣排空5?10 min并在瓶口涂抹凡士林密封后，分別置于?40 ℃、4 ℃、(27±4) ℃室溫和35 ℃條件下避光保藏，分別標(biāo)記為R1、R2、R3和R4。保藏時(shí)間共計(jì)107 d，分別在第1天，第51天和第107天取樣測(cè)定顆粒污泥濃度、厭氧氨氧化活性 (SAA)、血紅素、粒徑、沉降速度和EPS等顆粒污泥特性指標(biāo)，同時(shí)進(jìn)行透射電鏡 (TEM) 觀察和C/H/N/O元素分析。污泥保藏一段時(shí)間后，保藏玻璃瓶?jī)?nèi)污泥冷凍成塊，將其置于35 ℃水浴鍋內(nèi)加熱1 h，然后混勻取樣測(cè)定污泥特性。

http://journals.im.ac.cn/cjbcn

圖1 試驗(yàn)裝置和試驗(yàn)流程示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the experimental reactor and test procedure. The scale bar in R1–R4= 1.5 mm.

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

NH4+-N、NO2–-N和NO3–-N分別采用水楊酸?次氯酸鹽光度法、N?(1?萘基) ?乙二胺光度法和紫外分光光度法[16]；SS和VSS (生物量)：重量法[16]；沉降速度：重力沉降法[17]；顆粒粒徑：Image-Pro Plus 6.0軟件分析法；EPS提取采用熱提取法[18]，EPS中糖類 (PS) 和蛋白質(zhì)(PN) 的測(cè)定詳見(jiàn)Ma等[19]的方法；血紅素參照Berry和Trumpower[20]所述方法進(jìn)行測(cè)定；SAA的測(cè)定步驟詳見(jiàn)Yang等[21]的方法；顆粒污泥內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)特性通過(guò)TEM進(jìn)行觀察，其具體步驟參見(jiàn)Tang等[22]的方法；通過(guò)體視鏡 (Leica ES2，德國(guó)) 觀察顆粒污泥外觀結(jié)構(gòu)；C/H/N/O元素含量采用元素分析儀 (EA3000，意大利) 測(cè)定分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 厭氧氨氧化顆粒污泥培養(yǎng)階段

在培養(yǎng)厭氧氨氧化顆粒污泥過(guò)程中，UASB反應(yīng)器進(jìn)水基質(zhì)濃度始終為560 mg N/L。其中，進(jìn)水基質(zhì)摩爾比為1∶1。接種厭氧氨氧化污泥后，設(shè)定反應(yīng)器起始HRT為2.16 h，將其避光置于35 ℃恒溫室中調(diào)控運(yùn)行。當(dāng)基質(zhì)去除率(NRE) 穩(wěn)定至 (83.1±1.1)%時(shí)，縮小HRT至1.94 h，相應(yīng)的出水亞硝氮濃度逐漸增至113 mg/L。增大HRT至3.97 h，緩解亞硝酸鹽對(duì)AnAOB的抑制作用[1,23]。NRE逐漸增加至90.5%，改變進(jìn)水無(wú)機(jī)碳源，即將模擬廢水中KHCO3替換為相同堿度的NaHCO3(圖2)。同時(shí)，為維持反應(yīng)器內(nèi)較高的NRE，逐漸增大HRT至14.1 h，相應(yīng)的進(jìn)水基質(zhì)負(fù)荷 (NLR) 和基質(zhì)去除速率 (NRR) 分別降至0.96 kg N/(m3·d) 和(0.86±0.08) kg N/(m3·d)。其中，當(dāng)無(wú)機(jī)碳源為KHCO3時(shí)，厭氧氨氧化消耗單位氨氮對(duì)應(yīng)的亞硝氮轉(zhuǎn)化量 (RS) 與硝氮生成量 (RP) 分別為1.27±0.12和0.11±0.02；當(dāng)無(wú)機(jī)碳源為NaHCO3時(shí)，相應(yīng)的化學(xué)計(jì)量比RS和RP分別為1.35±0.21和0.13±0.04。第75 天，恢復(fù)模擬廢水無(wú)機(jī)碳源為KHCO3，根據(jù)NRE調(diào)整HRT，反應(yīng)器的厭氧氨氧化脫氮性能并未明顯改善 (圖2)，相應(yīng)的化學(xué)計(jì)量比RS和RP分別為1.22±0.22和0.15±0.04。第126 天，更換模擬廢水無(wú)機(jī)碳源為NaHCO3，依據(jù)NRE和出水亞硝氮濃度通過(guò)HRT調(diào)控NLR，逐漸培養(yǎng)厭氧氨氧化顆粒污泥，相應(yīng)的RS和RP分別為1.36±0.20和0.19±0.07。運(yùn)行至第346 天，反應(yīng)器HRT逐漸縮短至1.47 h，出水氨氮和亞硝氮分別為28.7 mg/L和78.3 mg/L。此時(shí)開(kāi)始厭氧氨氧化顆粒污泥保藏試驗(yàn)。由上述結(jié)果可知：將NaHCO3作為無(wú)機(jī)碳源，能夠成功替代KHCO3進(jìn)行厭氧氨氧化顆粒污泥的培養(yǎng)。相比于KHCO3，以NaHCO3作為無(wú)機(jī)碳源，相應(yīng)的RS值較大且更接近RS理論值 (1.32)；二者RP值略有差異，但均低于RP理論值(0.23)[24]。同時(shí)，陽(yáng)離子類型 (K+或Na+) 對(duì)AnAOB的脫氮性能具有一定的影響，其原因可能與AnAOB細(xì)胞內(nèi)外滲透壓或細(xì)胞膜上的鈉鉀泵有關(guān)[25-26]，其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

2.2 厭氧氨氧化顆粒污泥保藏階段

2.2.1 微生物量與衰減指數(shù)

經(jīng)過(guò)364 d的培養(yǎng)，混合后取樣測(cè)定SS和VSS分別為46.91 g/L和28.41 g/L，相應(yīng)的難揮發(fā)性污泥濃度為18.5 g/L。假定在污泥保藏過(guò)程中難揮發(fā)性污泥的量不變，則保藏過(guò)程中微生物量可通過(guò)測(cè)得SS后扣除難揮發(fā)性污泥濃度得出。不同溫度下避光保藏107 d的過(guò)程中，R1?R4內(nèi)微生物量如表1所示，均呈現(xiàn)不同程度的降低。其主要原因在于：在無(wú)基質(zhì)持續(xù)供給的情況下，R1?R4內(nèi)AnAOB生長(zhǎng)停止，同時(shí)微生物內(nèi)源呼吸作用仍然存在。

圖2 厭氧氨氧化顆粒污泥培養(yǎng)期UASB反應(yīng)器的脫氮性能Fig. 2 Performance of nitrogen loading/removal rate and applied HRT in a UASB reactor during the cultivation of Anammox granules.

利用一階衰減指數(shù)模型 (公式(1)) 擬合R1?R4內(nèi)微生物量的變化，對(duì)其進(jìn)行衰減動(dòng)力學(xué)分析，并計(jì)算相應(yīng)的半衰期 (THL) (公式 (2))。

其中，Y為剩余微生物量所占質(zhì)量百分比，%；A0為常數(shù)；bAN為衰減指數(shù)，1/d；t為保藏時(shí)間，d；THL為半衰期，d。

不同保藏溫度下R1?R4內(nèi)厭氧氨氧化顆粒污泥生物量的衰減擬合結(jié)果如圖3所示。一階衰減指數(shù)模型能夠較好地?cái)M合較寬溫度范圍內(nèi)(–40 ℃至35 ℃) 厭氧氨氧化顆粒污泥保藏過(guò)程中生物量的衰減過(guò)程。較低溫度范圍 (–40 ℃至4 ℃) 內(nèi)，bAN無(wú)顯著差異；較高溫度范圍 (4℃至37 ℃) 內(nèi)，bAN隨著保藏溫度的增加呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。相應(yīng)的R1和R2半衰期分別為76 d和77 d，約為R3和R4的2.5倍 (表2)。由此可知：低溫更適宜保藏過(guò)程中厭氧氨氧化顆粒污泥生物量的維持。相關(guān)研究表明[27-28]：在基質(zhì)供給充足的條件下，AnAOB的bAN為0.001?0.004 8 1/d，相應(yīng)的THL為693?145 d。本試驗(yàn)結(jié)果表明：在無(wú)基質(zhì)供給的條件下，R1?R4內(nèi)生物量的bAN為0.009?0.024 1/d，相應(yīng)的THL為29?77 d (表2)。二者相比，在無(wú)基質(zhì)供給時(shí)AnAOB的THL顯著縮短，其原因可能與無(wú)基質(zhì)供給導(dǎo)致大量AnAOB細(xì)胞死亡有關(guān)。相比于絮狀污泥[8]，相同保藏溫度條件下厭氧氨氧化顆粒污泥的THL更長(zhǎng)，其原因可能與顆粒污泥外EPS累積有關(guān)。Heylen等[13]發(fā)現(xiàn)，相比于待定斯圖加特庫(kù)氏菌Candidatus Kuenenia stuttgartiensis顆粒污泥，4 ℃冷藏易使單細(xì)胞培養(yǎng)的Ca. K. stuttgartiensis和待定黑海階梯烷菌屬Ca. Scalindua sp. 細(xì)胞胞溶，其原因可能是由于缺乏EPS對(duì)其保護(hù)。

圖3 不同保藏溫度下厭氧氨氧化顆粒污泥衰減動(dòng)力學(xué)擬合曲線Fig. 3 Decay kinetic simulation curves of Anammox granules under different preservation temperature.

表2 厭氧氨氧化菌 (AnAOB) 衰減動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Decay kinetic parameters of anaerobic ammonium-oxidizing bacteria (AnAOB)

2.2.2 活性與血紅素含量

除生物量外，生物活性也是影響厭氧氨氧化工藝脫氮性能的一個(gè)重要指標(biāo)。不同溫度下保藏不同時(shí)間，R1?R4內(nèi)SAA測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。保藏前期，R1和R2內(nèi)SAA顯著增加，保藏后期呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。整個(gè)保藏階段，R1和R2內(nèi)SAA值均高于SAA初始值 (表1)。與R1相比，R2內(nèi)SAA值相對(duì)較高且變化幅度較大。整個(gè)保藏階段，R3和R4內(nèi)SAA均呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，且R3內(nèi)SAA值高于R4。保藏前期，R3和R4內(nèi)活性保留率分別為63.5%和49.0%；保藏后期，R3和R4內(nèi)活性保留率分別為48.4%和41.7%。與R3相比，R4內(nèi)SAA值前期降低幅度較大，后期降低幅度較小。由上述結(jié)果可知：R1?R4內(nèi)活性保留率大小順序?yàn)镽2＞ R1＞ R3＞ R4。此外，采用一階衰減指數(shù)模型分別擬合R3和R4內(nèi)污泥活性的衰減過(guò)程，所得結(jié)果如下：

其中，Y’為剩余污泥活性所占起始活性的百分比，%。由此可知：R3和R4內(nèi)保藏污泥活性的衰減指數(shù)分別為0.007 3 1/d和0.010 1/d。根據(jù)公式 (2)，計(jì)算可得R3和R4內(nèi)污泥活性的半衰期分別為94 d和69 d，分別約為R3和R4內(nèi)生物量半衰期的2.9倍和2.4倍。生物量衰減得更快，尤其值得關(guān)注。此外，生物量與活性共同決定微生物的脫氮能力。由表1可知：在保藏過(guò)程中，R1的脫氮能力降低幅度小于R3和R4，而R2在保藏前期有增無(wú)減，保藏后期略有降低。經(jīng)過(guò)107 d的保藏后R1?R4內(nèi)微生物脫氮能力大小順序?yàn)椋篟2＞ R1＞ R3＞ R4。因此，4 ℃保藏更有利于維持厭氧氨氧化顆粒污泥的脫氮能力。

血紅素是AnAOB胞內(nèi)血紅蛋白的重要輔基，其含量影響厭氧氨氧化污泥外觀顏色的同時(shí)可用于指示活性[22,29]。由表1可知，保藏前期，R1?R4內(nèi)血紅素含量無(wú)顯著變化，不同于上述生物活性的變化規(guī)律；保藏后期，R1和R2內(nèi)血紅素含量比保藏起始值高2?3倍，R4內(nèi)血紅素含量降至保藏起始值的18.8%。保藏前期R4和保藏后期R3內(nèi)血紅素含量變化異常，其原因尚待證實(shí)。在厭氧氨氧化顆粒污泥保藏過(guò)程中，無(wú)基質(zhì)供給使得AnAOB正常代謝受阻，限制厭氧氨氧化活性的同時(shí)，AnAOB胞內(nèi)血紅素降解緩慢[15]，其變化很難和生物活性同步。此外，通過(guò)對(duì)比R1?R4內(nèi)血紅素含量變化與相應(yīng)厭氧氨氧化顆粒污泥外觀顏色 (圖1)，可知二者變化基本一致。然而，顆粒污泥外觀顏色還與保藏容器內(nèi)其他組分 (如S2–) 有關(guān)。因此，在厭氧氨氧化顆粒污泥保藏階段，血紅素不可直接指示活性衰減，而血紅素含量變化可通過(guò)污泥外觀顏色進(jìn)行初步判斷。

2.2.3 顆粒粒徑與沉降性能

厭氧氨氧化顆粒污泥粒徑應(yīng)適宜，既要足夠大，保證反應(yīng)器內(nèi)微生物有效持留；又不能過(guò)大，以避免顆粒內(nèi)部產(chǎn)氣形成氣囊導(dǎo)致污泥上浮進(jìn)而造成污泥流失[21]。同時(shí)，顆粒粒徑影響其沉降性能[17]。在不同保藏階段，R1?R4內(nèi)顆粒污泥的粒徑分析結(jié)果如表3所示。在保藏起始時(shí)段，顆粒污泥的最大粒徑為6.50 mm，粒徑大小為 (1.46±1.10) mm；同時(shí)，混合均勻后取樣測(cè)定其沉降速度，約有30.0% (按顆粒數(shù)計(jì))的顆粒污泥出現(xiàn)上浮，其上浮速度為(97.9±59.4) m/h，下沉顆粒污泥的沉降速度為(52.7±18.8) m/h (表1)。保藏前期，R1?R4內(nèi)顆粒污泥的最大粒徑均減小，且最大粒徑依次降低。粒徑分析可知：R3內(nèi)90%的粒徑小于2.31 mm，R4內(nèi)90%的粒徑小于2.24 mm，均低于保藏起始相應(yīng)值 (2.96 mm)；R1和R2無(wú)顯著變化。由此可知，隨著保藏溫度增加，R1?R4內(nèi)顆粒破碎程度依次增加，低溫保藏比高溫保藏更有利于顆粒粒徑的維持。同時(shí)，R1內(nèi)顆粒污泥沉降速度降至 (41.78±16.38) m/h，上浮顆粒污泥個(gè)數(shù)百分比降至4.2%，相應(yīng)的顆粒污泥上浮速度降至 (90.45±51.52) m/h；R2內(nèi)顆粒污泥沉降速度波動(dòng)較大，R3和R4內(nèi)顆粒污泥沉降速度均降低，且R2?R4內(nèi)均無(wú)顆粒上浮。在污泥保藏前期，EPS降低不利于顆粒污泥聚集成團(tuán)[30]，引起顆粒破碎進(jìn)而導(dǎo)致粒徑減小，使其沉降速度降低，同時(shí)上浮污泥比例及其上浮速度均降低。保藏后期，R1和R2內(nèi)最大顆粒污泥粒徑明顯降低，而R3和R4內(nèi)顆粒污泥粒徑無(wú)降低；與保藏起始時(shí)相比，保藏后期R1?R4內(nèi)顆粒污泥沉降速度均降低且無(wú)顆粒污泥上浮，其沉降速度大小順序?yàn)椋篟2＞ R3＞ R1＞ R4。因此，4 ℃條件下長(zhǎng)期保藏顆粒污泥，顆粒污泥破碎程度相對(duì)較小，沉降性能最優(yōu)。

表3 保藏階段R1?R4中厭氧氨氧化顆粒污泥粒徑Table 3 Diameters of Anammox granules in R1–R4during the preservation period

2.2.4 胞外聚合物

厭氧氨氧化顆粒污泥中EPS主要由PS和PN組成[31]。在保藏階段，R1?R4內(nèi)顆粒污泥EPS測(cè)定結(jié)果如表1所示。保藏前期，R1?R4內(nèi)EPS均降低，用以維持AnAOB胞內(nèi)代謝。保藏后期，R1?R4內(nèi)EPS均增加，其原因可能與AnAOB細(xì)胞衰亡破裂后胞內(nèi)物質(zhì)外流有關(guān)。保藏階段，R1?R4內(nèi)EPS的變化趨勢(shì)與相關(guān)研究結(jié)果一致[15]。此外，顆粒污泥EPS中PN/PS能有效指示顆粒污泥的沉降性能，PN/PS值越大沉降性能越好[32-34]。保藏前期，PN降低幅度小于PS，使得相應(yīng)的PN/PS值增加，而相應(yīng)的顆粒污泥的沉降性能并未改善；保藏后期，PN增加幅度大于PS，PN/PS值增加，而相應(yīng)的顆粒污泥沉降性能更差 (表1)。因此，保藏階段PN/PS不能直接用于指示顆粒污泥的沉降性能，需綜合考慮顆粒污泥粒徑變化和細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)是否完善等諸多因素。

2.2.5 透射電鏡分析

在保藏初期和末期，R1?R4內(nèi)厭氧氨氧化顆粒污泥TEM觀察結(jié)果如圖4所示。由圖4A可知，保藏起始階段，AnAOB為球形或橢球形，厭氧氨氧化體呈月牙形或啞鈴形，與文獻(xiàn)報(bào)道AnAOB的典型結(jié)構(gòu)一致[21-22]。經(jīng)過(guò)107 d的保藏，R1?R4內(nèi)AnAOB的細(xì)胞結(jié)構(gòu)均發(fā)生了不同程度的變化。其中，R1內(nèi)AnAOB出現(xiàn)部分細(xì)胞溶解和細(xì)胞濃縮成團(tuán)現(xiàn)象，如圖4B中箭頭所示；R2內(nèi)AnAOB細(xì)胞溶解現(xiàn)象不顯著，而厭氧氨氧化體相對(duì)稀疏 (圖4C)。由圖4D和4E可知：R3和R4內(nèi)均出現(xiàn)大量AnAOB細(xì)胞溶解和細(xì)胞中空現(xiàn)象，而R4內(nèi)AnAOB胞溶程度更大。由表2可知，R1?R4的bAN大小順序?yàn)椋篟4＞ R3＞R1＞R2，與R1?R4內(nèi)AnAOB胞溶程度正相關(guān)，進(jìn)而驗(yàn)證了一階衰減指數(shù)模型模擬結(jié)果。同時(shí)，不同保藏溫度下AnAOB細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)一步揭示了R1?R4內(nèi)污泥活性演變的內(nèi)在原因。

圖4 保藏初期和末期R1?R4內(nèi)厭氧氨氧化顆粒污泥透射電鏡圖Fig. 4 TEM images of Anammox granules from R1–R4on the 1st day (A), R1(B), R2(C), R3(D) and R4(E) on the 107th day. The scale bar in A = 0.2 μm; in B, C, D, and E = 0.5 μm.

表4 保藏階段R1?R4內(nèi)厭氧氨氧化顆粒污泥的元素組成及其元素比值Table 4 Elemental composition and atomic ratios of the Anammox granules from R1–R4during the preservation period

2.2.6 元素分析

通過(guò)分析顆粒污泥可揮發(fā)性部分的元素組成，可初步判斷主要功能菌的細(xì)胞元素組成。分析所得各元素組分與主要功能菌細(xì)胞元素組分的理論值越接近，說(shuō)明顆粒污泥內(nèi)主要功能菌豐度越高。因此，顆粒污泥元素組成的變化，可指示主要功能菌豐度的變化。保藏階段，對(duì)R1?R4內(nèi)厭氧氨氧化顆粒污泥進(jìn)行元素分析，結(jié)果如表4所示。Strous等[24]報(bào)道稱AnAOB的細(xì)胞分子式為CH2O0.5N0.15，將其相應(yīng)的C/H/N/O元素百分比作為理論值。培養(yǎng)階段所得厭氧氨氧化顆粒污泥中C/H/N均低于理論值，而O元素高于理論值。保藏前期，R1?R4內(nèi)C/H/N元素百分比均增加，而O元素所占百分比顯著下降。同時(shí)，混合取樣前觀察到R1?R4內(nèi)有氣泡產(chǎn)生，其中R1、R3和R4氣泡較多，R2內(nèi)幾乎無(wú)氣泡，這可能與AnAOB細(xì)胞溶解程度有關(guān)。此外，細(xì)胞溶解亦可使部分細(xì)胞組分流入液相，影響顆粒污泥C/H/N/O元素組成比例。保藏后期，R1和R2內(nèi)C/H/N/O變化同步，其中C/N/H元素百分比略有降低，O元素百分比略有增加；R3內(nèi)C/H/N/O元素百分比變化同保藏前期；R4內(nèi)C/H/N/O元素百分比變化與保藏后期R1和R2內(nèi)C/H/N/O元素百分比變化趨勢(shì)相同。同時(shí)，混合取樣前觀察到R1、R3和R4內(nèi)有少量氣泡，R2內(nèi)無(wú)氣泡生成。進(jìn)一步檢驗(yàn)生成的氣泡成分以及液相組分能夠更好地揭示污泥保藏過(guò)程中C/H/N/O的變化規(guī)律，進(jìn)而判定不同保藏溫度下R1?R4內(nèi)發(fā)生的反應(yīng)類型和胞溶程度，然后對(duì)其進(jìn)行調(diào)控可進(jìn)一步提高污泥保藏效果。

3 結(jié)論

在厭氧氨氧化顆粒污泥培養(yǎng)階段，KHCO3和NaHCO3均可作為AnAOB生長(zhǎng)的無(wú)機(jī)碳源。其中，碳酸氫鈉相對(duì)經(jīng)濟(jì)，可作為培養(yǎng)AnAOB的優(yōu)選無(wú)機(jī)碳源。在厭氧氨氧化顆粒污泥保藏階段，相比于–40 ℃、(27±4) ℃和35 ℃，4 ℃時(shí)生物量和活性衰減較少，沉降性能較優(yōu)，顆粒污泥破碎程度較小，TEM觀察未見(jiàn)胞溶現(xiàn)象。在厭氧氨氧化顆粒污泥保藏階段，一階衰減指數(shù)模型能夠較好地?cái)M合生物量及其活性的衰減過(guò)程，衰減指數(shù)與胞溶程度正相關(guān)，而且生物量的衰減比活性的衰減更快。

REFERENCES

[1] Strous M, Kuenen JG, Jetten MSM. Key physiology of anaerobic ammonium oxidation. Appl Environ Microb, 1999, 65(7): 3248–3250.

[2] Mulder A, van de Graaf AA, Robertson LA, et al. Anaerobic ammonium oxidation discovered in a denitrifying fluidized bed reactor. FEMS Microbiol Ecol, 1995, 16(3): 177–183.

[3] Tang CJ, Zheng P, Chen JW, et al. Start-up and process control of a pilot-scale Anammox bioreactor at ambient temperature. Chin J Biotech, 2009, 25(3): 406–412 (in Chinese).唐崇儉, 鄭平, 陳建偉, 等. 中試厭氧氨氧化反應(yīng)器的啟動(dòng)與調(diào)控. 生物工程學(xué)報(bào), 2009, 25(3): 406–412.

[4] Tang CJ, Zheng P, Chai LY, et al. Characterization and quantification of anammox start-up in UASB reactors seeded with conventional activated sludge. Int Biodeter Biodegr, 2013, 82: 141–148.

[5] Jin RC, Ma C, Yu JJ. Performance of an Anammox UASB reactor at high load and low ambient temperature. Chem Eng J, 2013, 232: 17–25.

[6] Tang CJ, Ping Z, Chen JW. Effect of sequential biocatalyst addition on Anammox process. Chin J Biotech, 2011, 27(1): 1–8 (in Chinese).唐崇儉, 鄭平, 陳建偉. 流加菌種對(duì)厭氧氨氧化工藝的影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2011, 27(1): 1–8.

[7] Li X, Zheng YH, Huang Y, et al. Effect of preservation temperature and time on ANAMMOX sludge activity. Chin Environ Sci, 2011, 31(1): 56–61 (in Chinese).李祥, 鄭宇慧, 黃勇, 等. 保存溫度及時(shí)間對(duì)厭氧氨氧化污泥活性的影響. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2011, 31(1): 56–61.

[8] Zheng YH, Li X, Huang Y. Study on the influence of preservation temperature on activity of ANAMMOX sludge. Environ Pollut & Control, 2011, 33(5): 82–86 (in Chinese).鄭宇慧, 李祥, 黃勇. 保藏溫度對(duì)厭氧氨氧化污泥活性的影響研究. 環(huán)境污染與防治, 2011, 33(5): 82–86.

[9] Adav SS, Lee DJ, Tay JH. Activity and structure of stored aerobic granules. Environ Technol, 2007, 28(11): 1227–1235.

[10] Gao D, Yuan X, Liang H. Reactivation performance of aerobic granules under different storage strategies. Water Res, 2012, 46(10): 3315–3322.

[11] Vlaeminck SE, Geets J, Vervaeren H, et al. Reactivation of aerobic and anaerobic ammonium oxidizers in OLAND biomass after long-term storage. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 74(6):1376–1384.

[12] Rothrock MJ, Vanotti MB, Sz?gi AA, et al. Long-term preservation of anammox bacteria. Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 92(1): 147–157. [13] Heylen K, Ettwig K, Hu ZY, et al. Rapid and simple cryopreservation of anaerobic ammonium-oxidizing bacteria. Appl Environ Microb, 2012, 78(8): 3010–3013.

[14] Ali M, Oshiki M, Okabe S. Simple, rapid and effective preservation and reactivation of an anaerobic ammonium oxidizing bacterium "Candidatus Brocadia sinica". Water Res, 2014, 57(15): 215–222.

[15] Wang CH, Zheng P, Cai J, et al. Preservation of ANAMMOX bacteria. Chin Environ Sci, 2013, 33(8): 1474–1482 (in Chinese).汪彩華, 鄭平, 蔡靖, 等. 厭氧氨氧化菌混培物保藏方法的研究. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2013, 33(8): 1474–1482.

[16] China Bureau of Environmental Protection. Methods for Monitor and Analysis of Water and Wastewater. 4th ed. Beijing: China Press of Environmental Science, 2002 (in Chinese).國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局. 水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法. 4版. 北京: 中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社, 2002.

[17] Lu HF, Ji QX, Ding S, et al. The morphological and settling properties of ANAMMOX granular sludge in high-rate reactors. Bioresour Technol, 2013, 143: 592–597.

[18] Sheng GP, Zhang ML, Yu HQ. Characterization of adsorption properties of extracellular polymeric substances (EPS) extracted from sludge. Colloids Surface B, 2008, 62(1): 83–90.

[19] Ma C, Jin RC, Yang GF, et al. Impacts of transient salinity shock loads on Anammox process performance. Bioresour Technol, 2012, 112: 124–130.

[20] Berry EA, Trumpower BL. Simultaneous determination of hemes a, b, and c from pyridine hemochrome spectra. Anal Biochem, 1987, 161(1): 1–15.

[21] Yang GF, Jin RC. Reactivation of effluent granular sludge from a high-rate Anammox reactor after storage. Biodegradation, 2013, 24(1): 13–32.

[22] Tang CJ, Zheng P, Wang CH, et al. Performance of high-loaded ANAMMOX UASB reactors containing granular sludge. Water Res, 2011, 45(1): 135–144.

[23] Lotti T, van der Star WRL, Kleerebezem R, et al. The effect of nitrite inhibition on the anammox process. Water Res, 2012, 46(8): 2559–2569.

[24] Strous M, Heijnen JJ, Kuenen JG, et al. The sequencing batch reactor as a powerful tool for the study of slowly growing anaerobic ammonium-oxidizing microorganisms. Appl Microbiol Biotechnol, 1998, 50(5): 589–596.

[25] Jin RC, Zheng P, Mahmood Q, et al. Osmotic stress on nitrification in an airlift bioreactor. J Hazard Mater, 2007, 146(1/2): 148–154.

[26] Wan CL, Yang X, Lee DJ, et al. Partial nitrification of wastewaters with high NaCl concentrations by aerobic granules in continuous-flow reactor. Bioresour Technol, 2013, 152: 1–6.

[27] Hao XD, Heijnen JJ, van Loosdrecht MCM. Model-based evaluation of temperature and inflow variations on a partial nitrification-ANAMMOX biofilm process. Water Res, 2002, 36(19): 4839–4849.

[28] Scaglione D, Caffaz S, Bettazzi E, et al. Experimental determination of Anammox decay coefficient. J Chem Technol Biotechnol, 2009, 84(8): 1250–1254.

[29] Jin RC, Yang GF, Zhang QQ, et al. The effect of sulfide inhibition on the ANAMMOX process. Water Res, 2013, 47(3): 1459–1469.

[30] Liu XW, Sheng GP, Yu HQ. Physicochemical characteristics of microbial granules. Biotechnol Adv, 2009, 27(6): 1061–1070.

[31] Xing BS, Qin TY, Chen SX, et al. Performance of the ANAMMOX process using multi- and single-fed upflow anaerobic sludge blanket reactors. Bioresour Technol, 2013, 149: 310–317.

[32] Cuervo-López FM, Martinez F, Gutiérrez-Rojas M,et al. Effect of nitrogen loading rate and carbon source on denitrification and sludge settleability in upflow anaerobic sludge blanket (UASB) reactors. Water Sci Technol, 1999, 40(8): 123–130.

[33] Franco A, Roca E, Lema JM. Granulation in high-load denitrifying upflow sludge bed (USB) pulsed reactors. Water Res, 2006, 40(5): 871–880.

[34] Su KZ, Yu HQ. Formation and characterization of aerobic granules in a sequencing batch reactor treating soybean-processing wastewater. Environ Sci Technol, 2005, 39(8): 2818–2827.

http://journals.im.ac.cn/cjbcn

Influence of preservation temperature on the characteristics of Anammox granular sludge

Baoshan Xing, Qiong Guo, Jue Zhang, Lixin Guo, and Rencun Jin
College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, Zhejiang, China

To study the effect of preservation temperature on the characteristics of anaerobic ammonium oxidation (Anammox) granules and optimize the preservation temperature of Anammox granules, the Anammox granules were cultivated in an upflow anaerobic sludge bed reactor through adjusting the hydraulic retention times, and the inorganic carbon with KHCO3/NaHCO3was alternately supplied. Subsequently, the enriched Anammox granules were preserved at?40, 4 and 35 ℃, and ambient temperature of (27±4) ℃. NaHCO3can be used as the inorganic carbon for the growth of anaerobic ammonium oxidizing bacterium (AnAOB). The best preservation temperature was 4 ℃ for maintaining Anammox biomass, Anammox activity, settleability, and the integrity of the Anammox granule and AnAOB cell structure.During the preservation period, the first-order exponential decay model can simulate the decay of Anammox biomass and activity, and the decay coefficients (bAN) of Anammox biomass and activity had positive correlation with the degree of AnAOB cell lysis. Meanwhile, the rate of Anammox biomass decay was larger than that of Anammox activity. The ratio of protein to polysaccharide in extracellular polymeric substances and heme c cannot effectively indicate the changes of Anammox granules settleability and activity, respectively, and the bioactivity has a negative association with the degree of AnAOB cell lysis.

Anammox, granular sludge, preservation temperature, granule characteristics

April 27, 2014; Accepted: July 25, 2014

Rencun Jin. Tel: +86-571-88062061; Fax: +86-571-28865333; E-mail: jrczju@yahoo.com.cn

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 51278162), Science and Technology Development Program of Hangzhou (No. 20120433B20).

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 51278162), 杭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No. 20120433B20)資助。

Received: April 27, 2014; Accepted: July 25, 2014

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 51278162), Science and Technology Development Program of Hangzhou (No. 20120433B20).

Corresponding author: Rencun Jin. Tel: +86-571-88062061; Fax: +86-571-28865333; E-mail: jrczju@yahoo.com.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 51278162), 杭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No. 20120433B20)資助。