尤升波　游銀偉

摘要：本試驗(yàn)就草酸青霉菌（Penicillium oxalicum）的固態(tài)發(fā)酵提取產(chǎn)物——果膠酶粗酶液誘導(dǎo)煙草對(duì)煙草花葉病毒（TMV）的抗性進(jìn)行了研究。以不同濃度果膠酶粗酶液噴霧處理2個(gè)煙草品種，超過(guò)100 U/mL的各濃度處理，病斑抑制率均達(dá)到50%以上。通過(guò)果膠酶誘導(dǎo)煙草抗病的時(shí)效性、加強(qiáng)誘導(dǎo)的效果、系統(tǒng)誘導(dǎo)抗病性、處理方法不同對(duì)煙草抗TMV效果以及果膠酶液對(duì)TMV病毒毒性的研究，結(jié)果表明：誘導(dǎo)處理2、4 d后接種TMV病毒，果膠酶的誘導(dǎo)抗病效果最明顯，病斑抑制率在50%左右；二次加強(qiáng)誘導(dǎo)處理可以提高煙草抗TMV的效果；果膠酶可誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生對(duì)TMV的系統(tǒng)獲得抗性；葉面噴霧果膠酶處理方法，對(duì)煙草抗TMV的效果最顯著；果膠酶液中不含有影響TMV致病力的因子。由此表明，果膠酶對(duì)TMV的防治是通過(guò)激發(fā)煙草植株體內(nèi)一系列抗病防御反應(yīng)而增強(qiáng)自身抗病能力的。

關(guān)鍵詞：草酸青霉菌；果膠酶；煙草花葉病毒；誘導(dǎo)抗病性

中圖分類號(hào)：S432.2：S435.72文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2014）05-0102-05

煙草花葉病毒?。═MV）是一種系統(tǒng)侵染性病害，在田間發(fā)生后危害嚴(yán)重，是世界各國(guó)煙草生產(chǎn)上重要的病害之一，每年都造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1，2]。眾所周知，煙草花葉病毒病在防治上相當(dāng)困難，迄今為止，還沒有發(fā)現(xiàn)能夠根除或有效治療植物病毒的措施。此外，一些新的煙草育苗技術(shù)，如漂浮育苗方法的大面積推廣應(yīng)用，也加重了TMV的發(fā)生[3]。

誘導(dǎo)抗病性是指植物在各種誘導(dǎo)因子的作用下，使其體內(nèi)存在的一系列潛在的與抗病性有關(guān)的基因誘導(dǎo)表達(dá)，從而使植物產(chǎn)生抗病性，即系統(tǒng)獲得抗性（SAR）[4]。近年來(lái)，隨著對(duì)誘導(dǎo)抗病性的深入研究，一系列環(huán)境友好型生物誘導(dǎo)劑為人們所開發(fā)、研究，其中主要包括植物源誘導(dǎo)抗病劑[5，6]及微生物源誘導(dǎo)抗病劑[7，8]。一些具有誘導(dǎo)抗病作用的激發(fā)子已經(jīng)開始在田間應(yīng)用[9]，從而為植物病害防治提供了一種新的途徑。彭霞薇等[10，11]的研究表明，草酸青霉菌固態(tài)發(fā)酵獲得的果膠酶具有誘導(dǎo)黃瓜抗黑星病的作用，而且可以提高黃瓜體內(nèi)多種防御酶系的含量[12]。但該發(fā)酵產(chǎn)物在誘導(dǎo)煙草植株抗TMV的研究方面，未見文獻(xiàn)報(bào)道。果膠酶作為工業(yè)酶制劑，在食品工業(yè)、紡織工業(yè)等行業(yè)中已有廣泛應(yīng)用[13]。它們?cè)谡T導(dǎo)植物抗病性方面的研究，將開拓果膠酶的應(yīng)用范圍，使其發(fā)揮更廣泛的作用?；诖耍驹囼?yàn)研究了草酸青霉菌（Penicillium oxalium）固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的果膠酶對(duì)TMV的抗性作用。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1植物材料及TMV供試煙草包括普通煙（Nicotiana tobacum L.）和心葉煙（Nicotiana glutinosa），普通煙品種為Xanthi-nc。煙草幼苗長(zhǎng)到6～8葉期時(shí)待用。試驗(yàn)所用TMV均由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系病毒室提供。

1.1.2果膠酶液的制備果膠酶發(fā)酵液（簡(jiǎn)稱果膠酶）的制備參照彭霞薇等[10]的方法。提取后的果膠酶于4℃冰箱中保存。果膠酶濃度根據(jù)每毫升酶液中含有的果膠酶活力單位確定，果膠酶活力單位（U）依據(jù)AJDA法確定[14]。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1果膠酶誘導(dǎo)煙草抗病性的初步測(cè)定分別配制濃度為10、20、40、60、100、150、200 U/mL的果膠酶溶液，均勻噴霧處理煙草全株葉片的正面和背面，每株煙草葉片果膠酶用量為10 mL，對(duì)照噴清水。3 d后，挑戰(zhàn)接種煙草花葉病毒（TMV）。選用上述2個(gè)煙草品種，每處理10株苗，接種6 d后調(diào)查葉片發(fā)病情況。

1.2.2果膠酶應(yīng)用時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)抗性的影響（1）接種TMV后24、48 h，分別用果膠酶噴霧處理煙草全株；（2）果膠酶與TMV汁液混合后同時(shí)摩擦接種處理煙草；（3）果膠酶誘導(dǎo)處理后1、2、4、6、8、10 d，挑戰(zhàn)接種TMV。果膠酶的使用濃度為100 U/mL。煙草品種為Xanthin-nc。接種6 d后調(diào)查葉片發(fā)病情況。

1.2.3果膠酶加強(qiáng)誘導(dǎo)煙草對(duì)TMV的抗性作用試驗(yàn)分2批處理，即誘導(dǎo)處理1次和誘導(dǎo)處理2次。誘導(dǎo)處理1次即以100 U/mL果膠酶液誘導(dǎo)處理煙草全株葉片。誘導(dǎo)處理2次即以100 U/mL果膠酶液誘導(dǎo)處理煙草全株葉片，3 d后再?gòu)?qiáng)化誘導(dǎo)處理1次。兩批植株在誘導(dǎo)處理0、1、2、4、8、12 d后分別接種TMV病毒汁液。煙草品種為Xanthi-nc。接種病毒6 d后，調(diào)查葉片發(fā)病情況。

1.2.4果膠酶的系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性試驗(yàn)取長(zhǎng)勢(shì)均一（10葉期）的煙草Xanthi-nc進(jìn)行試驗(yàn)，用于誘導(dǎo)處理的果膠酶液濃度為100 U/mL。在第5葉（從最底葉計(jì)），以噴霧誘導(dǎo)法進(jìn)行處理，以噴清水的煙草植株做對(duì)照。3 d后，分別在處理葉（第5葉）、處理葉上部的未處理葉片（第6、7、8葉）及處理葉下部未處理葉片（第3、4葉）表面，摩擦接種TMV汁液。接種6 d后調(diào)查各葉片發(fā)病情況。

1.2.5不同處理方法對(duì)果膠酶誘導(dǎo)抗病效果的影響采用3種不同的處理方法：①葉表面噴霧法。100 U/mL果膠酶液噴霧處理煙草中部葉片（即第4、5片葉），果膠酶液用量為10 mL，3 d后對(duì)處理葉和上部未處理的葉片（6～8葉）進(jìn)行TMV摩擦接種；②注射法。在處理葉片（選取第4和第5片葉）基部主脈兩側(cè)各注射一個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)各注射20 μL果膠酶溶液，3 d后以同樣方法加強(qiáng)誘導(dǎo)1次，第二次處理3 d后，在處理葉片及上部未處理葉片（6～8葉）上接種TMV；③灌根法。在接種TMV前7天，用100 U/mL果膠酶溶液灌根處理煙草植株，隔一天處理1次，連續(xù)處理3次，每次每株的果膠酶用量為10 mL，最后一次處理3 d后，在第4～8片葉上接種TMV。分別以清水代替果膠酶液作為對(duì)照。供試煙草品種為Xanthin-nc。接種6 d后，調(diào)查葉片發(fā)病情況。endprint

1.2.6果膠酶液對(duì)TMV的毒性試驗(yàn)將果膠酶配制成40、200、400 U/mL 3個(gè)濃度的溶液，分別與等體積TMV懸浮液混合，使果膠酶的最終濃度分別為20、100、200 U/mL。將混合液在4℃條件下放置0、4、8、12、24、48 h后，分別接種煙草植株第4～8葉，所用煙草品種為Xanthi-nc。接種6 d后調(diào)查各葉片發(fā)病情況。

1.3病情調(diào)查及誘導(dǎo)效果計(jì)算

病情調(diào)查項(xiàng)目分為枯斑數(shù)、枯斑大小，并計(jì)算枯斑抑制率。

枯斑抑制率（%）=（1-處理葉枯斑數(shù)/對(duì)照葉枯斑數(shù)）×100

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度果膠酶誘導(dǎo)煙草對(duì)TMV抗性作用

由表1可以看出，果膠酶液對(duì)2種煙草均有誘導(dǎo)抗病效果，且隨著果膠酶誘導(dǎo)濃度的提高，對(duì)煙草植株的抗病效果也逐漸增高。從心葉煙和Xanthi-nc產(chǎn)生枯斑情況來(lái)看，當(dāng)果膠酶的使用濃度高于100 U/mL（包括100 U/mL）時(shí)，對(duì)TMV在寄主上產(chǎn)生枯斑的抑制率均超過(guò)50%。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，在200 U/mL的果膠酶使用濃度下，如果誘導(dǎo)期間溫室環(huán)境溫度過(guò)高（超過(guò)35℃），則會(huì)對(duì)煙草葉片產(chǎn)生藥害。

2.2果膠酶應(yīng)用時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)抗性的影響

由圖1可以看出，果膠酶噴霧前先接種TMV或果膠酶液與TMV汁液混合后接種，均不能降低葉片枯斑數(shù)。而誘導(dǎo)噴霧后1～10 d再接種TMV，均能不同程度降低煙草葉片的枯斑數(shù)，且誘導(dǎo)后2、4 d接種TMV的植株，枯斑數(shù)的抑制效果最為明顯，病斑抑制率分別為49.54%和52.75%。由此也可以看出，果膠酶液對(duì)TMV沒有治療作用，它對(duì)TMV的防治作用是通過(guò)誘導(dǎo)煙草自身產(chǎn)生防御反應(yīng)來(lái)提高煙草抗TMV侵染的。

2.3果膠酶加強(qiáng)誘導(dǎo)對(duì)煙草抗TMV的影響

由圖2可見，誘導(dǎo)處理2次的煙草，每葉平均枯斑數(shù)在各接種時(shí)間內(nèi)均比誘導(dǎo)處理1次的要低，而且誘導(dǎo)抗病的持效期也長(zhǎng)于誘導(dǎo)處理1次的植株，誘導(dǎo)處理后10、12 d接種TMV時(shí)，誘導(dǎo)處理1次的植株病斑抑制率低于10%，而誘導(dǎo)處理2次的植株病斑抑制率仍在20%以上，對(duì)TMV仍有一定的誘導(dǎo)抗病作用。

2.4果膠酶的系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性試驗(yàn)

由表2可以看出，與對(duì)照相比，第5葉經(jīng)果膠酶誘導(dǎo)處理的植株中各葉位的平均枯斑數(shù)均有不同程度降低。通過(guò)計(jì)算病斑抑制率可以看出，在果膠酶誘導(dǎo)處理葉上的病斑抑制率最高，其次是緊靠處理葉的第6葉、第4葉，離處理葉片越遠(yuǎn)的葉片誘導(dǎo)效果相對(duì)越低（見圖3）。上述結(jié)果表明，果膠酶除了可以誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生對(duì)TMV局部抗性外，還可誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生對(duì)TMV的系統(tǒng)獲得抗性。由此可以推斷果膠酶在誘導(dǎo)煙草抗性中，產(chǎn)生一種可向上下移動(dòng)的信號(hào)分子，該信號(hào)分子可從處理部位傳導(dǎo)葉。下圖同。

到非處理部位并激活其防御系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)該部位產(chǎn)生抗性。

2.5不同處理方法對(duì)果膠酶誘導(dǎo)抗病效果的影響

由表3可見，用100 U/mL果膠酶以不同方法進(jìn)行誘導(dǎo)處理后，Xanthi-nc煙草的誘導(dǎo)抗TMV效果不同。其中以葉面噴霧處理誘導(dǎo)效果最顯著，病斑抑制率達(dá)46.24%；其次是葉柄注射誘導(dǎo)方法，病斑抑制率為19.70%；灌根處理對(duì)煙草抗TMV效果不理想，病斑抑制率僅為7.86%。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，灌根處理的植株生長(zhǎng)速度比對(duì)照略快些，可能是果膠酶液中的營(yíng)養(yǎng)成分被植株根吸收，從而促進(jìn)了植株生長(zhǎng)。

2.6果膠酶液對(duì)TMV的毒性試驗(yàn)

在試驗(yàn)使用的果膠酶濃度范圍內(nèi)，放置不同時(shí)間處理對(duì)TMV致病力均無(wú)影響，處理間每葉平均枯斑數(shù)差異不明顯（表4）。由此表明，果膠酶液中不含有影響TMV致病力的因子，煙草植株表現(xiàn)出的對(duì)TMV抗性提高可能是由于在果膠酶作用下，煙草植株體內(nèi)一系列抗病防御反應(yīng)被激活，增強(qiáng)了寄主自身的抗病能力。該試驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步證明，果膠酶具有誘導(dǎo)煙草抗TMV的作用。

3討論

利用果膠酶作為激發(fā)子誘導(dǎo)植物抗病性研究的文獻(xiàn)較少。Vidal等[15]的試驗(yàn)證明，煙草空脛病病菌（Erwinia carotovora subsp. carotovora）產(chǎn)生的果膠酶能夠誘導(dǎo)煙草對(duì)該病的抗性。彭霞薇等[10～12，16]的研究結(jié)果表明草酸青霉發(fā)酵產(chǎn)生的果膠酶粗酶液可以誘導(dǎo)黃瓜對(duì)黑星病的抗性，其中起主要誘導(dǎo)抗病作用的是果膠酶蛋白因子。本試驗(yàn)利用草酸青霉菌果膠酶發(fā)酵液誘導(dǎo)煙草對(duì)TMV的抗性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，在一定的應(yīng)用條件下，草酸青霉果膠酶能夠誘導(dǎo)煙草抗TMV。

在測(cè)定果膠酶濃度對(duì)誘導(dǎo)抗性的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨果膠酶濃度的增加，2種煙草對(duì)TMV的抗性也逐步增加，濃度超過(guò)100 U/mL后，其防病效果均在50%以上。在溫室溫度過(guò)高（35℃以上）時(shí)，果膠酶發(fā)酵液會(huì)對(duì)煙草葉片造成一定的傷害。

Sequeira[17]指出，激發(fā)子誘導(dǎo)處理后，寄主的誘導(dǎo)抗性表達(dá)需要一段時(shí)間的積累才能實(shí)現(xiàn)，即誘導(dǎo)抗性表達(dá)與誘導(dǎo)處理之間有一定的滯后性。以100 U/mL果膠酶噴霧誘導(dǎo)Xanthi-nc煙葉片，前后不同時(shí)間接種TMV，結(jié)果表明，2、4 d接種TMV的植株，對(duì)枯斑數(shù)的抑制效果最為明顯，枯斑抑制率分別為49.54%和52.75%。由此也說(shuō)明，果膠酶液對(duì)TMV無(wú)治療作用，它對(duì)TMV的防治作用是通過(guò)誘導(dǎo)煙草自身產(chǎn)生的防御反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。研究結(jié)果還表明，果膠酶液對(duì)TMV致病性無(wú)影響，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了果膠酶對(duì)TMV的防效是通過(guò)誘導(dǎo)植物自身抗病防御機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)的。兩次加強(qiáng)誘導(dǎo)既可以提高誘導(dǎo)抗病效果，還可以延長(zhǎng)誘導(dǎo)抗病效果的持續(xù)時(shí)間。

果膠酶誘導(dǎo)煙草對(duì)TMV的系統(tǒng)抗性試驗(yàn)結(jié)果表明，果膠酶既可誘導(dǎo)煙草對(duì)TMV的局部抗性，又可誘導(dǎo)對(duì)TMV的系統(tǒng)抗性，且離處理葉越遠(yuǎn)，誘導(dǎo)效果相對(duì)越低。該結(jié)果與果膠酶對(duì)黃瓜抗黑星病的作用不同，在黃瓜植株上，果膠酶不表現(xiàn)系統(tǒng)誘導(dǎo)抗病效果[10]。endprint

采用的誘導(dǎo)方法不同對(duì)果膠酶誘導(dǎo)抗性的發(fā)揮有很大影響，本試驗(yàn)結(jié)果表明，以葉片噴霧法處理黃化苗的誘導(dǎo)效果最好，果膠酶葉柄注射對(duì)Xanthi-nc煙抗TMV有一定的誘導(dǎo)效果，灌根處理的誘導(dǎo)抗TMV效果不明顯。

總之，對(duì)果膠酶誘導(dǎo)抗病的機(jī)制及誘導(dǎo)抗性范圍，仍有許多工作有待于深入開展，以便為其實(shí)際開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

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收稿日期：2014-01-03

基金項(xiàng)目：山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系小麥創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)和國(guó)家自然科學(xué)青年基金（31301320）資助。endprint

采用的誘導(dǎo)方法不同對(duì)果膠酶誘導(dǎo)抗性的發(fā)揮有很大影響，本試驗(yàn)結(jié)果表明，以葉片噴霧法處理黃化苗的誘導(dǎo)效果最好，果膠酶葉柄注射對(duì)Xanthi-nc煙抗TMV有一定的誘導(dǎo)效果，灌根處理的誘導(dǎo)抗TMV效果不明顯。

總之，對(duì)果膠酶誘導(dǎo)抗病的機(jī)制及誘導(dǎo)抗性范圍，仍有許多工作有待于深入開展，以便為其實(shí)際開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

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收稿日期：2014-01-03

基金項(xiàng)目：山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系小麥創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)和國(guó)家自然科學(xué)青年基金（31301320）資助。endprint

采用的誘導(dǎo)方法不同對(duì)果膠酶誘導(dǎo)抗性的發(fā)揮有很大影響，本試驗(yàn)結(jié)果表明，以葉片噴霧法處理黃化苗的誘導(dǎo)效果最好，果膠酶葉柄注射對(duì)Xanthi-nc煙抗TMV有一定的誘導(dǎo)效果，灌根處理的誘導(dǎo)抗TMV效果不明顯。

總之，對(duì)果膠酶誘導(dǎo)抗病的機(jī)制及誘導(dǎo)抗性范圍，仍有許多工作有待于深入開展，以便為其實(shí)際開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

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收稿日期：2014-01-03

基金項(xiàng)目：山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系小麥創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)和國(guó)家自然科學(xué)青年基金（31301320）資助。endprint