宋長(zhǎng)虹，唐生，佟馨，郝克非，尚剛，鄧斌

（1.中糧北海糧油工業(yè)（天津）有限公司，天津300454；2.中糧集團(tuán)油脂部生產(chǎn)與質(zhì)量安全部，北京100020）

食用油脂中苯并（α）芘檢測(cè)方法比較與優(yōu)化

宋長(zhǎng)虹1，唐生2，佟馨2，郝克非1，尚剛1，鄧斌1

（1.中糧北海糧油工業(yè)（天津）有限公司，天津300454；2.中糧集團(tuán)油脂部生產(chǎn)與質(zhì)量安全部，北京100020）

食用油中苯并（α）芘的檢測(cè)主要包括樣品的預(yù)處理和測(cè)定2個(gè)基本過程，由于植物油中苯并（α）芘含量極微，穩(wěn)定性差，樣品基體復(fù)雜且存在潛在的多種干擾物，如大量甘油三酯和脂肪伴隨物，所以如何快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出食品中的苯并（α）芘，就成為人們現(xiàn)階段研究的重點(diǎn)。以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T22509-2008《動(dòng)植物油脂苯并（α）芘的測(cè)定反相高效液相色譜法》為基礎(chǔ)，對(duì)幾種樣品前處理方法及液相色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

食用油；苯并（α）芘；對(duì)比；檢測(cè)方法

苯并芘（Benzopyrene），苯與芘稠合而成的一類多環(huán)芳烴，通常認(rèn)為苯并（α）芘是一種公認(rèn)的致癌物質(zhì)、斷裂劑、誘導(dǎo)有機(jī)體突變的物質(zhì)和環(huán)境污染物。油料在加工過程中因接觸污染物、高溫炒制、高溫精煉加工都會(huì)受到B（α）P污染，從而引發(fā)B（α）P向食用油遷移。許多國(guó)家和組織對(duì)直接消費(fèi)的植物油中B（α）P的含量有著嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)。歐盟規(guī)定食用油中B（α）P的最大限量為2μg/kg；國(guó)際食品法典委員會(huì)（CAC）規(guī)定食用油脂中B（α）P的最大限量為5μg/kg；我國(guó)GB 2716-2005《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定最大限量為10μg/kg[1-3]。

食用油中苯并（α）芘的分析主要包括樣品的預(yù)處理和測(cè)定2個(gè)基本過程。由于植物油中苯并（α）芘含量極微，穩(wěn)定性差，樣品基體復(fù)雜且存在潛在的多種干擾物，如大量甘油三酯和脂肪伴隨物，所以如何快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出食品中的苯并（α）芘，就成為人們現(xiàn)階段研究的重點(diǎn)。目前，食用油中苯并（α）芘的檢測(cè)方法主要有薄層層析法、熒光分光光度法、高效液相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用。薄層層析法是傳統(tǒng)的分析B（α）P方法，但此法的缺點(diǎn)是操作步驟繁多，分析周期較長(zhǎng)。熒光分光光度法樣品處理過程較為復(fù)雜，同時(shí)前處理一些熒光物質(zhì)有本底干擾，與液相色譜相比，此方法操作過程復(fù)雜，分析時(shí)間長(zhǎng)、準(zhǔn)確度低。高效液相色譜方法簡(jiǎn)便，安全性好，靈敏度高，線性范圍寬，精確度高，最小檢出限為0.1μg/kg。氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是鑒定中苯并（α）芘的最有效方法，此方法的分離效果及色譜重現(xiàn)性好，可用于復(fù)雜體系中痕量組分苯并（α）芘的定量測(cè)定，但對(duì)儀器要求比較高，成本較高，不利于推廣[4-6]。

以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T22509-2008《動(dòng)植物油脂苯并（α）芘的測(cè)定反相高效液相色譜法》為基礎(chǔ)，旨在對(duì)高效液相色譜法測(cè)定食用油中苯并（α）芘含量的幾種樣品前處理方法及色譜條件進(jìn)行研究及優(yōu)化，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

高效液相色譜儀：戴安UltiMate3000，帶自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（IKARv10）；VP50真空抽濾泵：北京萊伯泰克；H50循環(huán)水冷卻器：北京萊伯泰克；苯并芘SPE固定化萃取柱（22 g/60mL、500mg/6mL）；0.45μm微孔過濾膜（水系）、0.45μm微孔過濾膜（有機(jī)系）；微量移液器及配套吸頭10μL～100μL；天平：感量0.0001g；玻璃器皿：容量瓶（25mL）、帶塞比色管（10mL）、玻璃樣品瓶（1mL）、玻璃樣品瓶（2mL）、圓底燒瓶。

1.1.2 試劑

色譜級(jí)：正己烷或石油醚；乙腈；水；四氫呋喃；

分析純：丙酮；甲酸溶液；8%H3PO4-DMSO溶液；5%KOH溶液；異丙醇；苯并（α）芘標(biāo)準(zhǔn)品：100mg。

1.2 苯并（α）芘檢測(cè)方法

1.2.1 樣品前處理[7-11]

方法1：稱取混勻的油樣0.30 g與10mL玻璃管中，不超過0.31 g；向10mL玻璃比色管中加入約5mL的正己烷，蓋上塞子搖約5min，使油樣完全溶解；將溶解后的溶液倒入苯并芘SPE固定化萃取柱（22g/60mL）中，讓其緩慢流下不需加壓，液體流下之后往氧化鋁柱中加入正己烷加滿，濾完之后接著加滿，連續(xù)2次；水浴溫度65℃，轉(zhuǎn)速60 r/min，蒸發(fā)致平底燒瓶中剩余約0.5mL~1mL正己烷時(shí)停止蒸發(fā)；將平底燒瓶中的正己烷轉(zhuǎn)入玻璃離心管中，并用少量正己烷沖洗轉(zhuǎn)入其中，用高純氮?dú)鈱⑵浯蹈?；往玻璃離心管中加入900μL乙腈，再加入100μL四氫呋喃混合液，用微量移液器將其混勻，并將其轉(zhuǎn)入樣品瓶中，等待進(jìn)樣。

方法2：稱取混勻的油樣2.5 g于10mL玻璃管中，計(jì)重；向10mL玻璃比色管中加入5mL的四氫呋喃，并用乙腈定容至10mL，蓋上塞子搖約5min，使油樣完全溶解；將溶解后的溶液經(jīng)0.45μm微孔過濾膜（有機(jī)系）過濾至2mL樣品瓶中，等待進(jìn)樣。

方法3：稱取混勻的油樣0.2 g~0.4 g于10mL玻璃管中；向10mL玻璃比色管中加入約2mL的正己烷，蓋上塞子搖約5min，使油樣完全溶解；在苯并芘SPE固定化萃取柱（500mg/6mL）中依次加入5mL丙酮，2mL正己烷活化；將待凈化液加入苯并芘柱中（在柱中正己烷液面為2mm時(shí)上樣，此過程不要使柱干涸），流出液棄去；待上樣液完全流出后，用6mL的異丙醇/正己烷（體積比1∶4）溶液淋洗，淋洗液棄去，將小柱抽干；用6 mL丙酮解吸，收集解吸液；解吸液40℃氮?dú)獯蹈?，加?00μL乙腈，再加入100μL四氫呋喃混合液，用微量移液器將其混勻，并將其轉(zhuǎn)入樣品瓶中，等待進(jìn)樣。

方法4：稱取10 g樣品，用50mL正己烷分?jǐn)?shù)次溶解，加入90%甲酸提取2次后（每次10mL），加入8% H3PO4-DMSO溶液40mL，振搖2min，靜置分層，上層正己烷液中加入40mLDMSO，棄去上層正己烷溶液，合并2次DMSO提取液，加入30mL正己烷反提取1次，棄去正己烷洗液。正己烷洗后的DMSO提取液中加入70mL 1∶1 HCl溶液，振搖2min，后用正己烷提取2次，每次40mL，振搖2min，棄去下層，合并2次正己烷提取液。后用30mL 5%KOH溶液洗1次，蒸餾水洗2次，每次40mL，棄去水層，后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干，乙腈定容至0.5mL待測(cè)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

苯并（α）芘標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液：準(zhǔn)確稱取10mg苯并（α）芘于100mL容量瓶中，用甲苯溶解，定容。此溶液約含苯并（α）芘100mg/L，4℃保存，可存放6個(gè)月；取1 000mg/L苯并（α）芘標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL，定容至100mL，此溶液約含苯并（α）芘1mg/L；取1mg/L苯并（α）芘標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL定容至10mL，此溶液約含苯并（α）芘10μg/L。

將苯并（α）芘標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液稀釋為5種不同濃度溶液，每個(gè)溶液的濃度為1、2、4、8、10μg/kg；采用最佳液相色譜條件，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，以苯并（α）芘標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，作圖得苯并（a）芘的HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 色譜條件

色譜條件A（方法1-3）：流動(dòng)相：乙腈∶超純水（88∶12）；設(shè)置泵：流速1.0mL/min；EX激發(fā)波長(zhǎng)：384 nm，EM發(fā)射波長(zhǎng)：406 nm（熒光檢測(cè)器）；PAH多環(huán)芳烴柱（C 18，5μm，4.6×150mm）；柱溫箱溫度：30℃；分析時(shí)間：30min。

色譜條件B（方法4）：色譜柱（Microsorb-MV 100-5 C 18，250×4.6mm×1/4＂）；柱溫30℃；流動(dòng)相：乙腈-水（（88∶12，體積比）；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)296 nm（紫外檢測(cè)器）。

1.2.4 計(jì)算公式

采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間對(duì)樣品峰進(jìn)行準(zhǔn)確定性，采用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算定量。

計(jì)算：C=c×v×n/m

式中：C為樣品中B（α）P的濃度，（μg/kg），c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得提取液中B（α）P的含量，（μg/mL），v為提取液定容體積，mL，n為稀釋倍數(shù)，m為取樣質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品檢測(cè)結(jié)果

分別取大豆油一級(jí)、玉米油一級(jí)、芝麻油、花生油二級(jí)分別采用4種方法進(jìn)行苯并（α）芘含量檢測(cè)，同一樣品同一方法做平行試驗(yàn)，每個(gè)樣品2組，結(jié)果如下表1所示。

表1 樣品檢測(cè)結(jié)果Table1 The test results

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

色譜條件A：試驗(yàn)結(jié)果表明，苯并（α）芘含量與峰面積的線性范圍為1μg/mL~10μg/mL；回歸方程（y為峰面積，x為濃度，μg/mL）為y=12 897x-284.24，相關(guān)系數(shù)為R2=0.99。

色譜條件B：試驗(yàn)結(jié)果表明，苯并（α）芘含量與峰面積的線性范圍為0.1μg/mL~50μg/mL；回歸方程（y為峰面積，x為濃度，μg/mL）為y=3.199 98x-0.189 65，相關(guān)系數(shù)為R2=0.99。

2.3 檢測(cè)限

本試驗(yàn)以3倍噪音比來確定最低檢出限，10倍噪音比來確定定量限。得到色譜條件A的最低檢出限為0.1μg/kg，色譜條件B的最低檢出限為2.8μg/kg。

2.4 精密度試驗(yàn)

在選定的最佳色譜條件下，取含苯并（α）芘標(biāo)準(zhǔn)品于色譜條件A和色譜條件B分別重復(fù)進(jìn)樣，考察精密度。結(jié)果如表2所示。

表2 色譜條件A和色譜條件B的精密度Table2 The precision of the chrom atographic conditions A and B

續(xù)表2色譜條件A和色譜條件B的精密度Continue tab le2 The precision of the chromatographic conditions A and B

2.5 回收率試驗(yàn)

為考察4種方法的準(zhǔn)確度，以不含苯并（α）芘的空白油樣為樣品，設(shè)計(jì)15μg/kg的添加濃度，計(jì)算苯并（α）芘的回收率，結(jié)果見表3。

表3 不同方法苯并（α）芘回收率Table3 Rateof recovery in differentm ethods

3 結(jié)果與討論

1）從樣品前處理方法來看，方法1與方法3使用試劑和操作方法差別不大，主要區(qū)別在于苯并芘SPE固定化萃取柱選用不同，方法1選用22 g/60mL柱，方法3選用500mg/6mL柱，方法3與方法1相比較最大的優(yōu)勢(shì)是500mg/6mL柱的成本僅為22 g/60mL柱的三分之一，同時(shí)方法3前處理所用時(shí)間比方法1要短。方法2的操作步驟最為簡(jiǎn)便快捷，省去了固定化萃取柱的成本，但由于此方法未對(duì)樣品中脂肪進(jìn)行脫除，樣品進(jìn)入色譜柱后會(huì)對(duì)柱效產(chǎn)生一定的影響，應(yīng)用此方法需要定期對(duì)色譜柱效進(jìn)行評(píng)估，定期更換色譜柱。方法4主要采用提取方法，節(jié)省了固定化萃取柱的成本，但此方法步驟較繁瑣，前處理花費(fèi)時(shí)間略長(zhǎng)。

2）從精密度試驗(yàn)結(jié)果來看，色譜條件A與色譜條件B均能滿足檢測(cè)要求，色譜條件A精密度略高；前處理方法1-3中色譜條件A采用熒光檢測(cè)器，前處理方法4中色譜條件B采用紫外檢測(cè)器，對(duì)于大部分實(shí)驗(yàn)室液相色譜均配備紫外檢測(cè)器，方法4可節(jié)省很大的儀器成本。最低檢出限相比，色譜條件A為0.1μg/kg，色譜條件B為2.8μg/kg，如對(duì)檢出限要求不要的檢測(cè)來說，方法4是很好的選擇。

3）從2.1中樣品檢測(cè)結(jié)果來看，應(yīng)用前處理方法1、方法3和方法4的檢測(cè)結(jié)果比較穩(wěn)定，重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差符合檢測(cè)要求，方法2的重復(fù)性較差，平行試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果之間偏差較大。但方法2操作較便捷檢測(cè)時(shí)間短，應(yīng)用前處理方法2平行試驗(yàn)求平均值，對(duì)于生產(chǎn)型企業(yè)在線半定量檢測(cè)還是可以接受的方法。

苯并（α）芘作為食用油脂中十分重要的檢測(cè)指標(biāo)，關(guān)系的企業(yè)的每個(gè)產(chǎn)品質(zhì)量安全和食品安全，從原料采購(gòu)到過程加工再到產(chǎn)品出廠檢驗(yàn)，每一道工序必須進(jìn)行嚴(yán)格的控制的檢測(cè)。對(duì)于食用油脂生產(chǎn)企業(yè)來說，既需要提高生產(chǎn)效率、降低成本又要保證產(chǎn)品的食品安全，所以開發(fā)一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)方法成為迫切需求。

[1]楊業(yè)鵬,徐厚恩,蘆春林,等．苯并(a)芘對(duì)人體淋巴細(xì)胞遺傳損傷6項(xiàng)指標(biāo)的敏感性比較[J]．中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,1994,28(5):275-2771

[2]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部,中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2005

[3]李永和．3-4苯并芘(BaP)對(duì)糧食及食品的污染[J]．糧食科技與經(jīng)濟(jì),1997(4):37-38

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[11]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).動(dòng)植物油脂苯并(a)芘的測(cè)定反相高效液相色譜法[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2009

Edible Oil of Benzo（α）pyrene Detection M ethods of Com parison and Optim ization

SONGChang-hong1，TANGSheng2，TONGXin2，HAOKe-fei1，SHANGGang1，DENGBin1

（1.COFCO Northsea Oils&Grains Industries（Tianjin）Co.，Ltd.，Tianjin 300454，China；2.COFCO Oils Department of Quality&Safety，Beijing 100020，China）

Theedibleoilsbenzo（α）pyrene detectedmainly includessample pretreatmentand determination of basic processes，Because benzo（α）pyrene is the minimal content and poor stability in vegetable oil and complexityof the samplematrix such as triglyceridespotential interferencesestersand fatty accompaniment，etc. Sohow todetectbenzo（α）pyrene in the food quicklyand accurately，thatbecomesthe focusof the research stage. As thebasisof"animal fatbenzo（α）pyrenewasmeasured by RP-HPLC"of thenationalstandard GB/T22509-2008.Wemake optimizations for several samples preparation method and HPLC conditions and compare the results.

edible oil；benzopyrene；comparison；testmethod

2014-03-17

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.23.022

宋長(zhǎng)虹（1959—），男（漢），高級(jí)工程師，本科，研究方向：油脂生產(chǎn)工藝。