童方念，羅 超，羅丹，吳藝芳，駱明旭，王漢琴，孫設(shè)宗，王 玨，朱名安，趙萬紅

(湖北醫(yī)藥學(xué)院1.藥護學(xué)院；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北十堰 442000)

◇基礎(chǔ)研究◇

山奈酚對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用

童方念1，羅 超2，羅丹1，吳藝芳1，駱明旭1，王漢琴2，孫設(shè)宗2，王 玨2，朱名安2，趙萬紅2

(湖北醫(yī)藥學(xué)院1.藥護學(xué)院；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北十堰 442000)

目的 研究山奈酚對四氯化碳(CCl4)致小鼠急性肝損傷的保護作用并探討其作用機制。方法 昆明種雄性小鼠隨機分為空白對照組、模型組、陽性對照組(水飛薊賓組)和低、高劑量山奈酚組。前2組給予溶劑蒸餾水灌胃，其余組分別給予0.1 g/(kg·d)水飛薊賓或6 mg/(kg·d)、18 mg/(kg·d)山奈酚，連續(xù)7 d。末次灌胃2 h后，空白對照組腹腔注射花生油，其余各組腹腔注射1.5 mL/L CCl4花生油混合液，制備急性肝損傷模型。測定并比較各組小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，肝組織丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量或活力及肝臟病理學(xué)變化的差異。結(jié)果 與模型組比較，山奈酚低、高劑量均可明顯降低小鼠血清ALT和AST含量(P<0.05或P<0.01)，降低肝組織MDA含量(P<0.01)，增加SOD活力(P<0.05或P<0.01)，水飛薊賓對上述指標(biāo)有相似作用(P<0.05或P<0.01)。病理切片顯示，與模型組比較，水飛薊賓組和低、高劑量山奈酚組的肝細(xì)胞壞死范圍及程度均明顯減少，炎細(xì)胞浸潤程度明顯減輕，其中高劑量山奈酚組的效果最好。結(jié)論 山奈酚對CCl4致小鼠急性肝損傷有保護作用，其機制可能是山奈酚減少自由基的生成。

山奈酚；肝損傷；四氯化碳；自由基；谷丙轉(zhuǎn)氨酶；谷草轉(zhuǎn)氨酶；丙二醛；超氧化物歧化酶

山奈酚(kaempferol)又名山柰素、山柰黃酮醇、四羥基黃酮、百蕊草素，屬于黃酮類黃酮醇亞屬，分子式為C15H10O6，相對分子量為286.23。山奈酚主要來源于姜科植物山奈的根莖，并廣泛存在于各種植物的花、葉和果實中，現(xiàn)已從茶葉、椰菜、蜂膠、柚子及其他綠色植物中提取到它的單體[1]。因山奈酚具有抗炎、抗氧化、防癌等多種功效，可用于癌癥、心血管疾病、抗微生物感染等疾病的治療而受到人們廣泛關(guān)注[2]，但有關(guān)其對化學(xué)性肝損傷保護作用的研究未見報道。從傳統(tǒng)中草藥有效成分中發(fā)現(xiàn)新藥是現(xiàn)代藥學(xué)研究的熱點。本研究旨在觀察山奈酚對四氯化碳(CCl4)致急性肝損傷的保護作用及其可能機制，為增加山奈酚的臨床適應(yīng)癥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級昆明種雄性小鼠40只，體質(zhì)量20～22 g，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(鄂)20011-0008。動物置于室溫(22±1)℃，相對濕度65%及正常晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)光照時間環(huán)境下，食用標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水，處死12 h前禁食不禁水。

1.2 藥物、試劑及儀器 山奈酚(純度97%)和水飛薊賓(純度98%)均購自十堰市四維生物科技有限公司，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和考馬斯亮藍試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。ZS83-1型內(nèi)切式組織勻漿機(浙西機械廠)、722S可見分光光度計(上海第二光學(xué)儀器廠)、SH/YF-9光學(xué)顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器有限公司)、HH.S21-8電熱恒溫水浴鍋(上海博迅有限公司)、Konelab 60i全自動生化分析儀(芬蘭Konelab公司)。

1.3 小鼠CCl4肝損傷模型制備與分組 適應(yīng)性飼養(yǎng)小鼠1周后隨機分5組：空白對照組、模型組、陽性對照組(水飛薊賓組)和低、高劑量山奈酚組。空白對照組和模型組均給予溶劑20 mL/kg蒸餾水，其余組分別給予0.1 g/kg水飛薊賓或6 mg/kg、18 mg/kg山奈酚，每天灌胃1次，連續(xù)7 d，實驗期間小鼠自由進食與飲水。末次灌胃2 h后，空白對照組腹腔注射花生油10 mL/kg，其余各組均按10 mL/kg體重腹腔注射1.5 mL/L CCl4花生油混合液。末次給藥8 h后小鼠禁食不禁水。20 h后摘取小鼠眼球取血，分離血清，頸椎脫臼處死小鼠并取肝臟。

1.4 檢測指標(biāo) 小鼠眼球取血后，制備血清，用全自動生化分析儀測量其ALT、AST含量。

采集肝臟左小葉約0.4 g，用生理鹽水沖洗數(shù)次，用濾紙拭干后精確稱重，按質(zhì)量體積比1∶9加入4 ℃ 生理鹽水，在冰浴中制備組織勻漿，4 000 r/min離心5 min。取上清液4 ℃儲存?zhèn)溆谩y定各組肝組織勻漿中蛋白質(zhì)含量，用冰生理鹽水稀釋成4 mg/mL蛋白，按試劑盒說明測肝組織SOD和MDA活力和含量。

摘取肝右葉，置于40 g/L的多聚甲醛溶液中固定48 h，石蠟包埋切片，厚度約4 μm，常規(guī)Hematoxy-Eosin(HE)染色，于光鏡下觀察肝臟組織病理變化。

2 結(jié) 果

2.1 山奈酚對小鼠血清ALT、AST的影響 與對照組比較，模型組小鼠血清ALT、AST含量明顯升高(P<0.01)，提示CCl4肝損傷模型制備成功。與模型組比較，水飛薊賓組血清ALT和AST含量降低(P<0.05或P<0.01)，低、高劑量山奈酚組小鼠血清ALT、AST均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，且山奈酚作用呈劑量依賴性。與水飛薊賓組比較，高劑量山奈酚組降低ALT作用效果更好(P<0.01，表1)?？梢?，水飛薊賓和山奈酚對小鼠CCl4肝損傷有顯著的保護作用。

2.2 山奈酚對小鼠肝臟SOD、MDA的影響 與對照組比較，模型組小鼠肝臟SOD活力顯著降低(P<0.01)，MDA含量顯著升高(P<0.01)，提示造模成功。與模型組比較，水飛薊賓組小鼠肝臟SOD活力顯著升高(P<0.05)，MDA水平顯著降低(P<0.01)，低、高劑量山奈酚組小鼠肝臟SOD活力顯著升高，而MDA含量顯著降低(P<0.01，表2)?？梢?，山奈酚可對抗小鼠CCl4肝損傷致SOD活力降低和MDA含量的增加。

表1 山奈酚對CCl4致小鼠急性肝損傷血清ALT、AST的影響

Tab.1 Effects of kaempferol on the activities of serum ALT and AST in mice with acute liver injury induced by CCl4(±s , n=8)

與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.3 山奈酚對小鼠肝組織病理學(xué)的影響 光鏡下觀察，可見空白對照組肝細(xì)胞形態(tài)完整，排列整齊，無明顯異常。模型組可見肝小葉中肝細(xì)胞呈大片灶狀壞死，中央靜脈和匯管區(qū)有較多炎性細(xì)胞浸潤，與對照組比較有明顯差異，說明制備CCl4肝損傷模型成功。水飛薊賓組肝細(xì)胞大致正常，于匯管區(qū)有少量壞死及少量炎細(xì)胞浸潤，與模型組比較，肝細(xì)胞損傷有所減輕。低劑量山奈酚組肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈現(xiàn)點狀壞死，匯管區(qū)有炎細(xì)胞浸潤。高劑量山奈酚組肝細(xì)胞形態(tài)、分布基本正常，中央靜脈周邊有少數(shù)散在壞死，匯管區(qū)有散在的炎細(xì)胞浸潤，且肝細(xì)胞損傷數(shù)量、范圍、程度與低劑量組、水飛薊賓組比較明顯減輕。與模型組比較，低、高劑量組肝細(xì)胞損傷明顯減輕(圖1)。提示水飛薊賓及低、高劑量山奈酚對CCl4致急性肝損傷均有明顯保護作用。

表2 山奈酚對CCl4致小鼠急性肝損傷肝組織SOD、MDA的影響

Tab.2 Effects of kaempferol on the activities of liver SOD and MDA in mice with acute liver injury induced by CCl4(±s , n=8)

與對照組比較，**P< 0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

圖1 山奈酚對小鼠肝組織病理學(xué)的影響
Fig.1 Effects of kaempferol on liver histopathology of mice with acute liver injury induced by CCl4(HE, ×400)
A：對照組；B：模型組；C：水飛薊賓組；D：6 mg/kg山奈酚組；E：18 mg/kg山奈酚組。

3 討 論

CCl4肝損傷模型是研究肝損傷的經(jīng)典模型，常用于研究保肝、護肝藥物的藥效及其作用機制[3-4]。目前認(rèn)為CCl4引起肝損傷的機制是：CC14在肝微粒體細(xì)胞色素P450催化下生成三氯甲烷自由基(·CCl3)和過氧化三氯甲基(·CCl3OO)等自由基及大量活性氧產(chǎn)物，這些物質(zhì)可結(jié)合細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)并攻擊肝細(xì)胞膜，引起一系列脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使肝細(xì)胞發(fā)生變性、壞死、酶滲漏等。肝細(xì)胞中存在多種化學(xué)酶，肝細(xì)胞受損后ALT和AST從肝細(xì)胞質(zhì)和線粒體中釋放出來，使血清中含量增加[5-6]。因此，血清中ALT和AST含量可反映肝細(xì)胞損傷程度。研究結(jié)果顯示，山奈酚組與模型組相比，ALT和AST明顯降低，表明山奈酚能夠?qū)笴Cl4引起的肝細(xì)胞損傷，且其作用具有濃度依賴性。

MDA是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)終產(chǎn)物，可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、壞死，其含量的改變反映自由基損傷引發(fā)的脂質(zhì)過氧化情況[7]。研究結(jié)果顯示，模型組肝細(xì)胞MDA含量明顯高于對照組，說明肝細(xì)胞發(fā)生明顯的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。山奈酚組與模型組相比，肝組織中MDA明顯降低，表明山奈酚具有減少自由基生成，減輕肝細(xì)胞損傷的作用。SOD是體內(nèi)主要的抗氧化酶，屬于金屬蛋白酶，能夠清除體內(nèi)氧自由基，保護組織細(xì)胞免受自由基的攻擊。其水平高低間接反映機體清除自由基的能力，其水平的變化又間接反映機體氧自由基含量的變化[8]。與模型組比較，山奈酚組使SOD活性增加，表明其具有清除自由基，進而減輕肝細(xì)胞氧化損傷的作用。病理組織學(xué)顯示，山奈酚可明顯減輕肝細(xì)胞變性、壞死程度及損傷范圍，減輕炎細(xì)胞浸潤。其對肝組織形態(tài)的改善與生化指標(biāo)一致，進一步證實了山奈酚對CCl4所致肝損傷有保護作用。

文獻報道含酚羥基的化合物具有明顯的清除氧自由基作用，其作用可能與所帶酚羥基數(shù)目有關(guān)[9]。山萘酚又稱3，4′，5，7-四羥基黃酮，其4個羥基均可與活性自由基相結(jié)合。這可能正是山奈酚減輕氧化性肝損傷的機制。還有文獻報道黃酮類化合物對各種實驗性肝損傷均有不同的保護作用，其作用與其清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化、調(diào)節(jié)免疫功能等有關(guān)[10]。由此推斷，黃酮類物質(zhì)山奈酚正是通過減少自由基生成，減輕氧化損傷，進而發(fā)揮了對抗CCl4所致肝損傷的作用。

另外，陽性藥水飛薊賓是水飛薊素中具有生物活性的主要成分，是經(jīng)典的肝損傷修復(fù)藥物，有明顯的保護和穩(wěn)定肝細(xì)胞膜的作用，本研究結(jié)果與文獻報道一致[11]。而山奈酚也具有良好的肝保護作用，有望成為治療肝病的藥物。

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(編輯 國 榮)

Protective effects of kaempferol on CCl4-induced acute liver injury in mice

TONG Fang-nian1, LUO Chao2, LUO Dan1, WU Yi-fang1, LUO Ming-xu1,WANG Han-qin2, SUN She-zong2, WANG Jue2, ZHU Ming-an2, ZHAO Wan-hong2

(1. Institute of Medicine and Nursing; 2. Faculty of Basic Medical Sciences,Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China)

Objective To study the protective effects and mechanism of kaempferol on carbon tetrachloride (CCl4)-induced liver injury in mice. Methods Kunming male mice were randomly divided into blank control group, model group, positive control group, and low- and large-dose kaempferol groups. The first two groups were given distilled water and the other groups were given silybin at 0.1 g/kg body weight/d, and kaempferol at 6 and 18 mg/kg body weight/d for 7 consecutive days, respectively. The blank control group was intraperitoneally injected with peanut oil, and the other groups were intraperitoneally given 0.15% CCl4peanut oil solution at 2 h after the last administration in order to prepare acute liver injury mice models. The levels of serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST), and malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) in liver tissue in all groups were determined and compared. Meanwhile, liver histopathology was investigated. Results Compared with model group, kaempferol could significantly decrease ALT and AST activities in the mice serum (P<0.05 orP<0.01) and MDA in the liver tissue (P<0.01), and increase the activity of SOD in liver tissue (P<0.05 orP<0.01). Silybin had the similar actions. The pathologic examination showed that compared with those in model group, the range and degree of liver cell necrosis and inflammatory cell infiltration in silybin and kaempferol groups were significantly reduced, with high-dose kaempferol group having the strongest effects. Conclusion Kaempferol has a protective effect on CCl4-induced acute liver injury in mice. The mechanisms may be related to reducing the generation of free radicals.

kaempferol; liver injury; CCl4; free radical; alanine aminotransferase (ALT); aspartate aminotransferase (AST); malondialdehyde (MDA); superoxide dismutase (SOD)

2014-03-02

2014-06-16

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81341138)；湖北省2011協(xié)同創(chuàng)新中心基金 (No.4)；湖北省高等學(xué)校2013年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(No.201313249006) Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81341138), the Fund of Hubei 2011 Cooperative Innovation Center (No.4), and 2013 Undergraduate Students Innovation and Entrepreneurship Training Plans of Hubei Province (No.201313249006)

趙萬紅，博士，副教授.E-mail: zwanhong@sohu.com

童方念(1991-)，女(漢族)，研究生，主要從事生化藥理學(xué)研究. E-mail: 526644768@qq.com

時間：2014-09-16 11∶25 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140916.1125.002.html

R575.1

A

10.7652/jdyxb201406017