于嬋娟， 劉亞華， 田 亮， 黃春陽， 劉 濤， 蔣 暉

(新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科， 烏魯木齊 830011)

神經元突觸前膜所釋放的神經遞質和處于突觸后膜上的相應受體接觸所產生的突觸后效應多種多樣，其中最重要的效應之一是直接作用于突觸后膜配體門控離子通道產生突觸后電位。根據突觸后膜離子通道開放離子轉運的影響，突觸后電位分為興奮性突觸后電位(excitatory postsynaptic potential， EPSP),即神經遞質引起短暫的突觸后膜去極化，使神經元靜息電位改變產生興奮；抑制性突觸后電位(inhibitory postsynaptic potential ，IPSP),神經遞質引起短暫的突觸后膜超極化，使神經元興奮性遭到抑制。 其中處于突觸后膜上的GABAA受體為神經元主要的抑制性膜蛋白受體，該受體是一種配體門控的氯離子通道，由5個亞基組成。神經元(GABA)受體介導的抑制突觸傳遞的作用增強，其主要機制是許多全身麻醉用藥和GABAA受體相互作用直接或間接導致了氯離子內流的結果[1-2]。

依托咪酯(etomidate，ETO)是一種靜脈注射麻醉劑，因為起效快，恢復快，對心血管和呼吸系統(tǒng)沒有明顯的毒副作用，通常用于臨床麻醉誘導或者短小手術的麻醉。有研究表明，依托咪酯主要作用于中樞神經系統(tǒng)的GABAA受體，其不僅能增強γ-氨基丁酸(GABA)和GABAA受體結合所產生的效應，也可以直接作用于GABAA受體發(fā)揮類γ-氨基丁酸樣作用[3]。依托咪酯的麻醉作用主要是與γ-氨基丁酸(GABA)受體結合，使膜氯離子通道開放，氯離子內流使細胞膜超極化，從而抑制細胞的興奮性。

本研究應用全細胞膜片鉗技術，分析依托咪酯對大鼠海馬CA1區(qū)興奮性突觸后電流(excitatory postsynaptic currents，EPSCs)的電流-電壓(I-V)曲線的影響以及與外向整流單通道氯電流的關系，進一步揭示依托咪酯通過作用于GABA受體所產生的突觸后電流的細胞學機制。

1 材料與方法

1.1腦片的制備選取生長13～19 d的Wistar大鼠20只，雄性,空調室內飼養(yǎng)，控制室溫為22～25℃，濕度為40%～60%，自由進水進食。將大鼠迅速斷頭，使用外科器械去除顱骨，分離腦組織，切取海馬半球，遂迅速將所切取的海馬半球置于切片機載物臺上，放入裝有0～4℃人工冰水腦脊液(以95%O2/5%CO2飽和)的切片凹槽中。使用振動切片機切取400 μm厚的海馬腦部切片，后將其放置于37℃孵化槽中培養(yǎng)1 h，取出在室溫下培養(yǎng)1 h(孵化槽中仍灌注以95%O2/5%CO2飽和的人工腦脊液)。

1.2藥品與試劑人工腦脊液(NaCl 118，KCl 4.75，KH2PO41.19，NaHCO325，MgSO41.19，D-glucose 11，CaCl2·2H2O 2.94，pH=7.4)；電極內液(K-gluconate 170，HEPES 10，NaCl 10，MgCl22，EGTA 0.2，Mg-ATP 3.5，Na-GTP 1.0，pH=7.2),以上藥物濃度單位均為mmol/L。

依托咪酯脂肪乳(2 mg/mL,中國徐州恩藥業(yè)集團有限公司有限公司，批號H20120511)。10%脂肪乳劑(樂山譽衡藥業(yè)公司，批號0020801)。

1.3電生理記錄所有實驗均控制在室溫18～23℃下進行。將所制備腦片移放到記錄槽中，通過水管道以95%O2/5%CO2飽和的人工腦脊液持續(xù)灌注，流速控制為2 mL/min左右，凹槽灌注溫度為30～32℃，循環(huán)液體容積為50 mL。利用拉制儀將硅硼玻璃管拉制成實驗用記錄電極，電極電阻為3.5～5 MΩ。隔離器連接雙極電刺激Schaeffer 側支/聯合纖維(刺激沖動性為0.1 ms)，間隔為20 s; 記錄CA1區(qū)錐體神經元細胞EPSC。刺激強度最大為50%為宜，保持膜鉗制電位為-70 mV。

全細胞記錄使用Axopatch 200B膜片鉗放大器，電刺激脈沖和信號采集以及單通道氯電流頻譜記錄均由計算機程序Clampx9.0及digidata1320A接口完成。采樣頻率為10 KHz，Bessel低通濾波器的頻率設定為2 KHz。連續(xù)監(jiān)測接觸電阻(access resistance，Ra)，只分析Ra穩(wěn)定的細胞。采集數據使用pClamp 8.0軟件進行整合分析，整合通道開放概率(P)通過公式NP=∑{t1+t2+t3…+tn}(n=10)進行處理，其中t為各樣本通道開放增強時間占總刺激時間的比例。

1.4實驗分組將20張制備的大腦切片(n=20)分為60 μL脂肪乳劑組(n=10)和10 μmol/L依托咪酯組(n=10)。 使用60 μL脂肪乳劑以及依托咪酯10 μmol/ L分組培養(yǎng)大腦切片40 min[4]，觀察待基線穩(wěn)定后，Schaeffer 側支/聯合纖維給予單一刺激，同時改變CA1區(qū)錐體神經元膜鉗制電位(-100 mV～ +40 mV，幅度為20 mV)，每個分段鉗制電壓給予1次電刺激，實時記錄單通道氯離子整合電流通道開放強度，繪制電壓-電流(I-V)曲線。

1.5統(tǒng)計學處理使用Clamfit9.0和Origin5.0軟件進行數據分析。EPSC頻率值做標準化處理，即檢測數據以相對于每組基線均值的比值或百分率表示為均數±標準差(-x±s)。組內比較采用配對t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1依托咪酯對大鼠海馬CA1區(qū)的I-V曲線的影響10 μmol/L依托咪酯組和60 μL脂肪乳劑組根據膜鉗制電壓測得的相對化EPSC數值見表1。隨著膜鉗制電位的變化，10 μmol/L依托咪酯組的相對EPSC值在-60、-40、-20、0、20及40 mV均高于60 μL脂肪乳劑組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 10 μmol/L依托咪酯及60 μL脂肪乳劑對相對EPSC的影響(-x±s， mV)

注：與60 μL脂肪乳劑組相比較，P<0.05。

根據該表制圖后形成圖1，改變膜鉗制電壓(-100～+40 mV)，發(fā)現脂肪乳劑組反轉電位為-53 mV左右，10 μmol/L依托咪酯組為-60 mV左右，經統(tǒng)計學處理，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明10 μmol/L依托咪酯降低反轉電位，使I-V曲線左移。

全程實時記錄外向整流單通道氯電流通道的開放概率，脂肪乳劑組膜鉗制電壓(-100～+40 mV)時通道開放NP頻譜見圖2；依托咪酯組膜鉗制電壓(-100～+40 mV)時通道開放NP頻譜見圖3。與脂肪乳劑組比較，依托咪酯組在各個膜鉗制電壓檢測點氯離子通道開放概率更頻繁。

3討論

GABA神經元在大腦的海馬結構中分布非常廣泛，其釋放的抑制性氨基酸GABA具有極其重要的生理作用，特別在錐體細胞、海馬中間神經元之間建立的快突觸傳導通路以及中隔與海馬中間神經元的GABA能神經傳導通路中，GABA均是其突觸連接間最為主要的抑制性神經遞質。 而GABAA受體是一種神經遞質門控的氯離子通道，是由5個亞基組成的膜蛋白受體，不同的亞基又包含不同的亞型，主要有6類α亞基(α1～α6 )、4類β亞基(β1～β4)、4類γ亞基(γ1～γ4)及δ、ε、θ和П亞基等。均是由5個亞基包圍分子中心區(qū)域形成一個由神經遞質γ-氨基丁酸門控性的氯離子通道[5-6]。

配體門控離子通道是一類與相應受體偶聯于同一跨膜蛋白大分子上的通道，受體未與遞質結合時，該通道呈關閉狀態(tài)，突觸后膜保持靜息電位[7-9]。一旦神經遞質與相應受體結合使后者激活時，受體蛋白分子結構變構，離子通道打開形成貫通細胞膜的雙向離子通道，離子出現跨膜轉運，其順膜電化學梯度出現的轉運形成打破靜息電位的膜電位差，形成動作電流，進而形成動作電位。當以上作用于突觸結構時，通過已打開的突觸后膜的配體門控離子通道所產生的電流，集成為突觸后電流。其膜內外形成的總電位差稱為突觸后電位。突觸后電流類型可按照其最終形成的突觸后電位分為興奮性突觸后電流(excitatory postsynaptic current，EPSC)和抑制性突觸后電流(inhibitory postsynaptic current，IPSC)。正常情況下，突觸前膜釋放的興奮性氨基酸神經遞質谷氨酸和突觸后膜的AMPA和NMDA受體結合產生內向的陽離子電流(即EPSC)，其主要開放Na+離子通道和Ca2+離子通道。而GABAA受體屬于配體門控的陰離子通道，主要與抑制性氨基酸神經遞質γ-氨基丁酸結合，對Cl-通透，發(fā)生Cl-內流，從而使突觸后膜超級化對神經元信號傳導產生抑制性的作用。

本實驗進一步分析10 μmol/L依托咪酯對EPSC的電流-電壓曲線的影響，發(fā)現依托咪酯可使I-V曲線左移，使反轉電位由-53 mV降低為-60 mV左右，說明了參與構成EPSC的離子發(fā)生了變化，其中外向的電流有所增加。通過數據處理整合單通道氯電流的開放NP頻譜圖可以得知在這一時刻氯的外向電流明顯增強，氯通道的開放程度加大，故進一步闡述了所增加的外向電流主要是由氯離子的跨膜內流轉運引起的。

正常情況下，氯離子對靜息膜電位的貢獻很小，而胞內外氯離子濃度為細胞膜電位所調節(jié)并受到膜上存在的任何氯離子轉運機制的調節(jié)。氯離子的跨膜轉運，產生的電位結果可能是超極化的，也可以是去極化的，這種效應依賴于氯離子的平衡電位相對于靜息電位為負或為正，而其又取決于細胞內氯離子轉運系統(tǒng)所起的作用是消耗還是聚集。在靜息電位去極化作用越是明顯的細胞中，麻醉藥物引起的超極化作用也就越大，這與麻醉藥物引起的K+和Cl-跨膜轉運作用非常一致，這些離子轉運出現的電位變化結果與細胞的靜息電位狀態(tài)十分相近，其結果可能更好地解釋了其超極化機制與細胞復極化之間的相似關系。同時，全身麻醉類藥物降低海馬神經元的膜電阻，增加氯離子通道的開放率，使海馬神經元氯離子內向轉運顯著增強，細胞膜電位差進一步加大。因此，本研究結果提示，依托咪酯作用于神經元突觸結構，與膜上GABAA受體結合，直接或間接改變了構成EPSCs的離子成分，使外向電流增加，且該外向電流很可能主要為氯離子的跨膜轉運所形成。

參考文獻：

[1] Bruce E, Herring M, Carolyn P,et al. Etomidate and propofol inhibit the neurotransmitter release machinery at different sites[J].Physiology，2011,589(5):1103-1115.

[2] Christian G, Rachel J, Uwe R, et al. Modulation of presynaptic β3-containing GABAAreceptors limits the immobilizing actions of GABA ergic anesthetics[J]. Mol Pharmacol， 2007,72(8):780-787.

[3] Erwin H，Jacob Engelmann,Kirsty G,et al.Etomidate Reduces initiation of backpropagating dendritic action potentials:Implications for sensory processing and synaptic plasticity during anesthesia[J]. Neurophysiology， 2007,97(2):2373-2384.

[4] 于嬋娟,劉濤,蔣暉，等.依托咪酯對大鼠海馬CA1區(qū)興奮性突觸后電流的影響[J].江蘇醫(yī)藥,2012,20(37):1023-1025.

[5] 李建國,李曉明，胡平，等.成年大鼠海馬ca1區(qū)錐體神經元外向整流氯離子單通道特性[J].生物化學與生物物理進展,2003,30(6):874-878.

[6] 陳瑛,蘇瑞斌.氯離子通道和藥物靶標[J].國際藥學研究雜志,2009,36(6):457-460.

[7] 孫雪華,林群,曾邦雄.依托咪酯易化大鼠海馬CA1區(qū)長時程抑制的誘導[J].福建醫(yī)科大學學報,2005,39(2):133-136.

[8] 王浩森.氯離子通道生理藥理學特點及相關疾病的研究進展[J].臨床與醫(yī)療,2012,11:489-491

[9] 謝玉波,施小彤,劉敬臣.異丙酚或依托咪酯對戊四唑誘發(fā)大鼠海馬CAl區(qū)神經元動作電位和突觸傳遞的影響[J].中華麻醉學雜志,2007,27(7):591-593.