易萌等

摘要：從淫羊藿根、莖、葉分離出23株內(nèi)生真菌，對分離出的真菌利用瓊脂塊法進行初選與濾紙片法進行復選，并以金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、灰霉病菌（Botrytis cinerea） 4 種微生物為指示菌對分離到的內(nèi)生真菌進行抗菌活性檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離得到的內(nèi)生真菌中有10株菌株具較好的抑菌活性。對大腸埃希菌抑菌效果最好的為標號K7的菌株，抑菌圈直徑為18.0 mm；對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌效果最好的均為標號B3的菌株，其抑菌圈直徑分別為18.0、15.0 mm；而對灰霉病菌抑菌效果最好的為標號K6的菌株，其抑菌圈直徑達到12.0 mm。

關(guān)鍵詞：淫羊藿；內(nèi)生真菌；抑菌活性

中圖分類號：S482.2+92；Q939.9 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）03-0327-03

淫羊藿，為小檗科植物淫羊藿、箭葉淫羊藿、巫山淫羊藿、朝鮮淫羊藿等多種淫羊藿的莖葉[1]，主產(chǎn)于貴州、遼寧等省[2-3]，夏、秋季采收，割取莖葉，除去雜質(zhì)，曬干。淫羊藿莖葉含有淫羊藿苷和揮發(fā)油。中醫(yī)學認為淫羊藿性味辛甘、溫，有補腎壯陽、祛風除濕的功效；同時，淫羊藿還可以抑制血管運動中樞，擴張周圍血管，使血壓下降，對脊髓灰質(zhì)炎病毒、白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌等有顯著的抑制作用。淫羊藿在臨床上主要用于治療生殖、骨關(guān)節(jié)、呼吸系統(tǒng)疾病[4-5]。

植物內(nèi)生真菌（endophyte fungus）是指在健康植物寄生的、在各種組織和器官內(nèi)部或細胞間隙中進行部分或全部生活周期而不使宿主表現(xiàn)明顯病理癥狀的一類真菌[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌普遍存在于植物組織內(nèi)，并和宿主植物長期共生，與宿主在遺傳、生理、代謝等方面相互滲透、同步進化，形成互利互惠的共生關(guān)系，使得它極有可能與宿主交換遺傳信息，從而產(chǎn)生相似或相同生理活性的次級代謝產(chǎn)物[7]。1993年Stierle等從短葉紅豆杉內(nèi)生真菌中分離得到紫杉醇后，國內(nèi)外學者從多種藥用植物中陸續(xù)分離得到產(chǎn)生活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌[6，8]，因此具有重要經(jīng)濟價值的藥用植物內(nèi)生真菌已成為篩選新藥物的潛在資源[9-12]。

本試驗以貴州省貴陽市郊的野生淫羊藿（Epimedium）為材料進行內(nèi)生真菌的分離，并對其抗菌活性進行初步研究，以獲得產(chǎn)生生物活性次生代謝產(chǎn)物的藥用微生物，進而為新型抗菌物質(zhì)的獲得開辟一條新路徑。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與內(nèi)生真菌的分離

淫羊藿樣品采自貴州省貴陽市郊。采集的新鮮植物樣品4 ℃保存，72 h內(nèi)處理。

1.2 供試指示菌

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、灰霉病菌（Botrytis cinerea），均由貴州師范大學微生物實驗室保存。

1.3 試驗流程

淫羊藿內(nèi)生真菌分離及抑菌活性試驗流程見圖1。

1.4 內(nèi)生真菌的分離、純化

將采集的新鮮樣品用自來水洗凈泥土等臟物，根、莖、葉分別切為0.5 cm的小片。在無菌條件下，對樣本進行表面消毒，具體步驟如下：無菌水沖3次，Tween-20 處理30 s，8%次氯酸鈉溶液消毒5 min，無菌水沖洗3 次，75%乙醇浸泡5 min，無菌水洗滌3次。同樣無菌條件下將樣本切成0.2 cm×0.2 cm 大小接種于PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)至出現(xiàn)菌落，從菌落邊緣取菌絲分別接種于新鮮平板，經(jīng)反復轉(zhuǎn)接得到純化菌株，保藏待用[13]。

1.5 指示菌的培養(yǎng)

將枯草芽胞桿菌和大腸埃希菌的單菌落接種于5 mL 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18 h，將金黃色葡萄球菌單菌落接種于LB培養(yǎng)基，用無菌水制備濃度約為 2.2×105 CFU/mL 的菌懸液，灰霉病菌在PDB培養(yǎng)基里 28 ℃ 搖床振蕩3 d，取100 μL 菌懸液接種于PDA固體培養(yǎng)基上，用玻璃環(huán)涂抹，進行抑菌試驗。

1.6 抗菌活性菌株的初選

采用瓊脂塊法對所分離得到的內(nèi)生真菌進行抗菌活性的初選，具體步驟如下：用打孔器從在PDA平板上生長的菌落上截取直徑為6.0 mm的瓊脂塊，用無菌鑷子將瓊脂塊放置于涂有指示菌的PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察及測量抑菌圈直徑[14]，重復3次。

1.7 抗菌活性菌株的復選

檢測活性菌株發(fā)酵液的抑菌活性，作為活性菌株的復選方法，具體步驟如下：將初選菌株接種于100 mL PDB液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)8 d，4 000 r/min 離心15 min，收集上清，過濾除菌，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將90 mL發(fā)酵液縮至1 mL。將紙片放在涂有指示菌的PDA平板上，點入20 μL發(fā)酵液在紙片上，28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察并測量抑菌圈的直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 淫羊藿內(nèi)生真菌分離結(jié)果

采用組織分離法從淫羊藿葉、莖、根中共分離得到23株菌落形態(tài)特征有差異的內(nèi)生真菌，其中A類菌株有6株，B類有10株，K類有7株，試驗部分菌株形態(tài)見圖2，其生態(tài)學和分子生物學鑒定還有待研究。

2.2 淫羊藿內(nèi)生真菌抑菌活性初步測定

用瓊脂塊法從23株內(nèi)生真菌中初選抗菌活性較強的菌株。結(jié)果表明，A1、A3、A4、B3、B7、B8、K6、K7、K8、K9等10株內(nèi)生真菌對大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和灰霉病菌均有一定的抑菌活性（表1）。

由表1可知，對大腸埃希菌抑菌效果最好的是K6、K7，抑菌圈直徑分別達17.0、18.0 mm，其次是A4、B3、B8，抑菌圈直徑為13.0 mm。B3對枯草芽孢桿菌抑菌圈直徑達到 18.0 mm，效果最好。對金黃色葡萄球菌抑菌效果顯著的是B3、K7、K6，抑菌圈直徑分別為15.0、14.0、13.0 mm。對真菌指示菌灰霉病菌而言，K6抑制其生長的效果最好，抑菌圈直徑為12.0 mm，其次，A3、B3、K7的抑菌效果也很好。

3 結(jié)論

本試驗通過瓊脂塊法從淫羊藿中篩選得到了具有抗菌活性的A1、A3、A4、B3、B7、B8、K6、K7、K8、K9等10株菌株，測定了其抑菌直徑，根據(jù)初選試驗可以得出結(jié)論：從不同指示菌株來看，對大腸埃希菌抑菌效果最好的是K6和K7；對枯草芽孢桿菌抑菌效果最好的是B3和K6；對金黃色葡萄球菌抑菌效果最佳的是B3和K7；對灰霉病菌抑菌效果最好的是K6。對于內(nèi)生真菌來說，A1對大腸埃希菌抑菌效果更好；A3對枯草芽孢桿菌抑菌效果不錯；A4對大腸埃希菌抑菌效果更佳；B3對枯草芽孢桿菌抑菌效果更好；B7和B8、K8和K9對幾種指示菌的抑菌效果相差不大；K6和K7對大腸埃希菌抑菌效果更佳。

在復選活性測定中有4株菌株具較好的抑菌活性，B3、B8、K9對灰霉病菌菌株有較強的抑菌活性，B3、B7則對大腸埃希菌抑菌活性明顯，初步顯示B3菌株有廣譜的抑菌活性。對初選具抑菌活性的10種菌株的鑒定還有待進一步的分子試驗。

植物內(nèi)生真菌的特殊生境決定了其具有重要的農(nóng)藥和醫(yī)藥應用潛力，而具抗菌、抗腫瘤活性菌株豐富的次生代謝產(chǎn)物已成為藥物來源新途徑，必將在天然藥物研究中得到開發(fā)與利用。試驗證實，淫羊藿植物內(nèi)生真菌豐富，分離的部分內(nèi)生真菌菌株具明顯的抗菌活性，對其活性成分進一步分離、分析，對新型藥物的篩選具重要意義[15]。

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