孫俊

摘要：為探索一種南果梨葉片離體培養(yǎng)高效再生的方法，以南國(guó)梨離體培養(yǎng)試管苗葉片為材料，在MS基本培養(yǎng)基中添加6-BA、NAA、IAA進(jìn)行離體培養(yǎng)，系統(tǒng)地研究植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度、苗齡、不同部位葉片、接種方向、溫度、pH值及光照強(qiáng)度對(duì)南國(guó)梨葉片離體培養(yǎng)再生的影響。結(jié)果表明，MS+5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+ 7 g/L 瓊脂+30 g/L 蔗糖為南國(guó)梨葉片再生芽誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率最高，為46.1%；選擇25～35 d苗齡葉片、近葉柄處遠(yuǎn)軸面向上葉片可獲得高再生頻率；南果梨葉片離體再生的適宜條件為：溫度（25±2） ℃，pH值為5.8～64，高光照強(qiáng)度。

關(guān)鍵詞：南果梨；葉片再生；離體培養(yǎng)；影響因素

中圖分類號(hào)： S661.204+.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）03-0044-03

南果梨（Pyrus ussuriensis Maxim.）屬于薔薇科（Rosaceae）梨亞科（Pomaceae）梨屬（Pyrus L.）植物[1]，是秋子梨（Pyrus ussuriensis Maxim.）中優(yōu)良的地方品種之一[2-3]。該品種果實(shí)色澤鮮艷、果肉細(xì)膩、爽口多汁，風(fēng)味香濃，深受人們歡迎，市場(chǎng)發(fā)展前景十分廣闊[4]。但南國(guó)梨果實(shí)成熟集中，不耐儲(chǔ)運(yùn)，柜臺(tái)壽命短，限制了南國(guó)梨的發(fā)展。常規(guī)育種過程相對(duì)較慢，難以解決此問題。隨著農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的發(fā)展，通過基因工程技術(shù)加快南國(guó)梨耐儲(chǔ)品種的培育將成為解決南國(guó)梨保鮮的一條新捷徑。而在轉(zhuǎn)基因研究中，成功的基因轉(zhuǎn)化首先依賴于高效穩(wěn)定的再生系統(tǒng)。原生質(zhì)體培養(yǎng)與葉片培養(yǎng)是目前運(yùn)用最廣泛的轉(zhuǎn)基因植株再生系統(tǒng)[5]。葉圓盤法因能避免對(duì)原生質(zhì)體的繁瑣操作而成為基因轉(zhuǎn)移中最常用的方法[6]。梨屬植物葉片的再生已有報(bào)道[7-12]， 但未有南果梨葉片離體培養(yǎng)再生體系建立及其影響因素研究的報(bào)道。本研究以南果梨試管苗葉片為試材，建立高頻穩(wěn)定的葉片離體再生體系為目的，以MS基本培養(yǎng)基添加6-BA、NAA、IAA進(jìn)行離體培養(yǎng)，系統(tǒng)地進(jìn)行植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度、苗齡、不同部位葉片、接種方向、溫度、pH值及光照強(qiáng)度對(duì)南國(guó)梨葉片離體培養(yǎng)再生影響的研究。本試驗(yàn)旨在研究葉片離體再生不定芽的影響因素，建立簡(jiǎn)單、快速、高效的葉片離體再生體系，從而為進(jìn)一步利用基因工程技術(shù)對(duì)南國(guó)梨進(jìn)行遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為采自遼寧省鞍山市的大紅南果的一年生枝條，在無菌條件下培育出的試管苗。

1.2 方法

1.2.1 不同激素組合對(duì)葉片再生不定芽誘導(dǎo)的影響 取繼代培養(yǎng)25～35 d的試管苗頂部生長(zhǎng)健壯、完全展開的幼葉，將其放在無菌濾紙上，然后用解剖刀在葉片背面（遠(yuǎn)軸面）垂直中脈橫劃3刀，但不要完全切斷葉片的上表皮。葉片再生芽誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，不同激素組合見表1，附加蔗糖30 g/L，pH值5.8。培養(yǎng)溫度為（25±2） ℃，每天光照 8～10 h，光照強(qiáng)度2 500～3 000 lx。葉片接種后50 d，調(diào)查葉片再生效率和再生芽數(shù)。

1.2.2 試驗(yàn)葉片的苗齡對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響 采用離體培養(yǎng)25、35、60、90、120 d組培苗葉片進(jìn)行葉片苗齡對(duì)再生頻率的影響研究。選取上部1～3葉位幼嫩葉片，垂直主脈橫切2刀，將葉塊近軸面向下接種于分化培養(yǎng)基上。

1.2.3 葉片種方方向?qū)θ~片再生不定芽的影響 設(shè)葉片遠(yuǎn)軸面和近軸面接觸培養(yǎng)基2種接種方法處理，接種于MS+ 5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖培養(yǎng)基上，對(duì)比觀察不定芽的誘導(dǎo)情況。培養(yǎng)及調(diào)查方法同“1.2.1”部分。

1.2.4 葉片不同部位對(duì)葉片再生不定芽的影響 取繼代培養(yǎng)35 d的無菌苗葉片。在葉片的基部、中部和尖部垂直于中脈各切1刀，接種在篩選出的含適宜激素的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖）上，每瓶放3張葉片，重復(fù)8次。培養(yǎng)及調(diào)查方法同“1.2.1”部分。

上述試驗(yàn)均為每瓶接種9個(gè)葉塊（3張葉），隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每處理10瓶，重復(fù)3次。試驗(yàn)再生培養(yǎng)基為MS+5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖。

1.3 結(jié)果調(diào)查與統(tǒng)計(jì)分析

在葉片接種30 d后對(duì)不定芽的再生率和平均每個(gè)葉塊的分化不定芽數(shù)進(jìn)行調(diào)查。結(jié)果用DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，百分率經(jīng)反正弦轉(zhuǎn)換。再生頻率=再生不定芽的葉塊數(shù)/接種葉塊數(shù)×100%；葉塊平均再生芽數(shù)（個(gè)/葉塊）=葉塊再生不定芽總數(shù)/出芽葉塊數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素組合對(duì)葉片再生的影響

接種后2周，葉片開始膨脹，邊緣逐漸向中央無規(guī)則卷起，葉片傷口處長(zhǎng)出少量的白色愈傷組織，質(zhì)地松散。3周左右，傷口處形成致密的愈傷組織，顏色由暗黃至深褐，體積迅速增大。5周時(shí)，傷口末端的愈傷組織處開始分化出綠色芽點(diǎn)（圖1-A）。7周后，不定芽分化率迅速上升，此后不定芽不斷伸長(zhǎng)（圖1-B）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片再生頻率和再生不定芽數(shù)量開始增加。

表1表明，附加適宜的生長(zhǎng)素可提高芽的再生頻率，但不同種類生長(zhǎng)素誘導(dǎo)芽的效果不同，IAA效果不如NAA；IAA或NAA濃度一定下，6-BA濃度越大，葉片再生頻率越高，但相同6-BA濃度下，同濃度NAA比IAA效果好。以MS為基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)南國(guó)梨葉片不定芽再生的最適6-BA濃度為 5 mg/L。在6-BA濃度為5.0 mg/L的條件下，0.2 mg/L NAA的誘導(dǎo)率最高，為46.1%。因此，MS+5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖為南國(guó)梨葉片再生芽誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基。

2.2 苗齡對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

培養(yǎng)中的外植體細(xì)胞團(tuán)由于不斷繼代，其形態(tài)發(fā)生能力可能保持，也可能喪失，產(chǎn)生不正常植株的頻率也會(huì)增加。因此，筆者對(duì)不同苗齡南果梨葉片離體再生情況進(jìn)行了研究。結(jié)果（表2）表明，25、35 d苗齡的離體再生頻率顯著大于 60 d 苗齡，極顯著大于90、120 d，而25、35 d苗齡間差異不顯著。因此，選擇25～35 d苗齡葉片作為獲得高再生頻率的試材。

3 結(jié)論與討論

3.1 外源激素的影響

在不同生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的配合使用中，兩者的比例十分重要。有研究證明，細(xì)胞分裂素類似物質(zhì)腺嘌呤與生長(zhǎng)素IAA之間的濃度配比可有效地控制植物組織培養(yǎng)中芽和根器官的發(fā)生。本試驗(yàn)支持此觀點(diǎn)。本研究以在MS基本培養(yǎng)基上添加 6-BA 與NAA組合較6-BA與IAA組合更有利于不定芽的再生。這與孫清榮等研究結(jié)果[8]一致，與劉洪章等的研究結(jié)果[13]正好相反。培養(yǎng)基中激素的種類、濃度、配比不同造成生長(zhǎng)和分化能力不同，可能是因?yàn)樗鼈兇碳ち瞬煌蚩刂频拿割?，從而影響?nèi)源激素的分布水平，進(jìn)而在生長(zhǎng)和分化上形成差異[14]。

3.2 苗齡的影響

隨著繼代次數(shù)增多，培養(yǎng)中的外植體器官形成的能力會(huì)發(fā)生改變。對(duì)不同苗齡葉片的再生能力進(jìn)行比較試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，苗齡越大，再生頻率越低，苗齡25～35 d的葉片再生能力最強(qiáng)。這可能與葉片的生理狀態(tài)有關(guān)，不同苗齡的葉片基因組中代謝基因及其活性不同，導(dǎo)致酶的活性及內(nèi)源激素水平的差異，在外源激素及其他環(huán)境因素的作用下，表現(xiàn)出不同的再生能力[15]。

3.3 外植體放置方向的影響

以南果梨葉片遠(yuǎn)軸面接觸培養(yǎng)基，其再生頻率高于近軸面接觸培養(yǎng)基的處理，這與劉洪章等的研究結(jié)果[13，16-17]一致，所以接種時(shí)以遠(yuǎn)軸面向下為宜。

3.4 培養(yǎng)溫度的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)南果梨葉片再生芽有明顯影響，27 ℃以上明顯不利于葉片生長(zhǎng)，與吳祿平等在蘋果品種試管苗葉片再生不定芽的研究結(jié)果[18]一致，造成這種現(xiàn)象的原因可能是溫度過高，使參與新陳代謝酶的活性受到抑制，從而使代謝過程和生長(zhǎng)速率受到抑制，進(jìn)而影響葉片再生。

參考文獻(xiàn)：

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[8]孫清榮，劉慶忠，趙瑞華. 西洋梨葉片直接再生體細(xì)胞胚[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2003，30（1）：85-86.

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[12]韓繼成，馮志紅，陳霜瑩. 梨離體葉片誘導(dǎo)不定芽的研究[J]. 河北果樹，1998（2）：12.

[13]劉洪章，譚雪輝，鄭 濤. 山梨葉片再生體系的研究[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30（4）：472-476.

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[16]韓清芳，徐凌飛，馬鋒旺，等. 梨葉柄再生不定芽的研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2002，22（6）：1485-1488.

[17]孫清榮，石蔭坪，孫洪雁.梨成熟胚子葉不定梢誘導(dǎo)[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，22（2）：50-52.

[18]吳祿平，張志宏，林麗華，等. 蘋果品種試管苗葉片再生不定芽[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，26（2）：131-135.

2.2 苗齡對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

培養(yǎng)中的外植體細(xì)胞團(tuán)由于不斷繼代，其形態(tài)發(fā)生能力可能保持，也可能喪失，產(chǎn)生不正常植株的頻率也會(huì)增加。因此，筆者對(duì)不同苗齡南果梨葉片離體再生情況進(jìn)行了研究。結(jié)果（表2）表明，25、35 d苗齡的離體再生頻率顯著大于 60 d 苗齡，極顯著大于90、120 d，而25、35 d苗齡間差異不顯著。因此，選擇25～35 d苗齡葉片作為獲得高再生頻率的試材。

3 結(jié)論與討論

3.1 外源激素的影響

在不同生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的配合使用中，兩者的比例十分重要。有研究證明，細(xì)胞分裂素類似物質(zhì)腺嘌呤與生長(zhǎng)素IAA之間的濃度配比可有效地控制植物組織培養(yǎng)中芽和根器官的發(fā)生。本試驗(yàn)支持此觀點(diǎn)。本研究以在MS基本培養(yǎng)基上添加 6-BA 與NAA組合較6-BA與IAA組合更有利于不定芽的再生。這與孫清榮等研究結(jié)果[8]一致，與劉洪章等的研究結(jié)果[13]正好相反。培養(yǎng)基中激素的種類、濃度、配比不同造成生長(zhǎng)和分化能力不同，可能是因?yàn)樗鼈兇碳ち瞬煌蚩刂频拿割?，從而影響?nèi)源激素的分布水平，進(jìn)而在生長(zhǎng)和分化上形成差異[14]。

3.2 苗齡的影響

隨著繼代次數(shù)增多，培養(yǎng)中的外植體器官形成的能力會(huì)發(fā)生改變。對(duì)不同苗齡葉片的再生能力進(jìn)行比較試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，苗齡越大，再生頻率越低，苗齡25～35 d的葉片再生能力最強(qiáng)。這可能與葉片的生理狀態(tài)有關(guān)，不同苗齡的葉片基因組中代謝基因及其活性不同，導(dǎo)致酶的活性及內(nèi)源激素水平的差異，在外源激素及其他環(huán)境因素的作用下，表現(xiàn)出不同的再生能力[15]。

3.3 外植體放置方向的影響

以南果梨葉片遠(yuǎn)軸面接觸培養(yǎng)基，其再生頻率高于近軸面接觸培養(yǎng)基的處理，這與劉洪章等的研究結(jié)果[13，16-17]一致，所以接種時(shí)以遠(yuǎn)軸面向下為宜。

3.4 培養(yǎng)溫度的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)南果梨葉片再生芽有明顯影響，27 ℃以上明顯不利于葉片生長(zhǎng)，與吳祿平等在蘋果品種試管苗葉片再生不定芽的研究結(jié)果[18]一致，造成這種現(xiàn)象的原因可能是溫度過高，使參與新陳代謝酶的活性受到抑制，從而使代謝過程和生長(zhǎng)速率受到抑制，進(jìn)而影響葉片再生。

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[8]孫清榮，劉慶忠，趙瑞華. 西洋梨葉片直接再生體細(xì)胞胚[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2003，30（1）：85-86.

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[10]劉翠瓊. 梨的離體培養(yǎng)與葉片不定梢誘導(dǎo)研究[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003：32-40.

[11]李海云，王中偉，邢少辰，等. 早梨18號(hào)葉片不定芽誘導(dǎo)及植株再生的研究[J]. 北方園藝，2008（9）：151-153.

[12]韓繼成，馮志紅，陳霜瑩. 梨離體葉片誘導(dǎo)不定芽的研究[J]. 河北果樹，1998（2）：12.

[13]劉洪章，譚雪輝，鄭 濤. 山梨葉片再生體系的研究[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30（4）：472-476.

[14]黃學(xué)林，李筱菊. 高等植物組織培養(yǎng)離體培養(yǎng)的形態(tài)建成及調(diào)控[M]. 北京：科學(xué)出版社，1995：78-80.

[15]布賴恩特J A. 植物基因表達(dá)的分子基礎(chǔ)[M]. 朱至清，譯. 北京：科學(xué)出版社，1986：274.

[16]韓清芳，徐凌飛，馬鋒旺，等. 梨葉柄再生不定芽的研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2002，22（6）：1485-1488.

[17]孫清榮，石蔭坪，孫洪雁.梨成熟胚子葉不定梢誘導(dǎo)[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，22（2）：50-52.

[18]吳祿平，張志宏，林麗華，等. 蘋果品種試管苗葉片再生不定芽[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，26（2）：131-135.

2.2 苗齡對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

培養(yǎng)中的外植體細(xì)胞團(tuán)由于不斷繼代，其形態(tài)發(fā)生能力可能保持，也可能喪失，產(chǎn)生不正常植株的頻率也會(huì)增加。因此，筆者對(duì)不同苗齡南果梨葉片離體再生情況進(jìn)行了研究。結(jié)果（表2）表明，25、35 d苗齡的離體再生頻率顯著大于 60 d 苗齡，極顯著大于90、120 d，而25、35 d苗齡間差異不顯著。因此，選擇25～35 d苗齡葉片作為獲得高再生頻率的試材。

3 結(jié)論與討論

3.1 外源激素的影響

在不同生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的配合使用中，兩者的比例十分重要。有研究證明，細(xì)胞分裂素類似物質(zhì)腺嘌呤與生長(zhǎng)素IAA之間的濃度配比可有效地控制植物組織培養(yǎng)中芽和根器官的發(fā)生。本試驗(yàn)支持此觀點(diǎn)。本研究以在MS基本培養(yǎng)基上添加 6-BA 與NAA組合較6-BA與IAA組合更有利于不定芽的再生。這與孫清榮等研究結(jié)果[8]一致，與劉洪章等的研究結(jié)果[13]正好相反。培養(yǎng)基中激素的種類、濃度、配比不同造成生長(zhǎng)和分化能力不同，可能是因?yàn)樗鼈兇碳ち瞬煌蚩刂频拿割?，從而影響?nèi)源激素的分布水平，進(jìn)而在生長(zhǎng)和分化上形成差異[14]。

3.2 苗齡的影響

隨著繼代次數(shù)增多，培養(yǎng)中的外植體器官形成的能力會(huì)發(fā)生改變。對(duì)不同苗齡葉片的再生能力進(jìn)行比較試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，苗齡越大，再生頻率越低，苗齡25～35 d的葉片再生能力最強(qiáng)。這可能與葉片的生理狀態(tài)有關(guān)，不同苗齡的葉片基因組中代謝基因及其活性不同，導(dǎo)致酶的活性及內(nèi)源激素水平的差異，在外源激素及其他環(huán)境因素的作用下，表現(xiàn)出不同的再生能力[15]。

3.3 外植體放置方向的影響

以南果梨葉片遠(yuǎn)軸面接觸培養(yǎng)基，其再生頻率高于近軸面接觸培養(yǎng)基的處理，這與劉洪章等的研究結(jié)果[13，16-17]一致，所以接種時(shí)以遠(yuǎn)軸面向下為宜。

3.4 培養(yǎng)溫度的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)南果梨葉片再生芽有明顯影響，27 ℃以上明顯不利于葉片生長(zhǎng)，與吳祿平等在蘋果品種試管苗葉片再生不定芽的研究結(jié)果[18]一致，造成這種現(xiàn)象的原因可能是溫度過高，使參與新陳代謝酶的活性受到抑制，從而使代謝過程和生長(zhǎng)速率受到抑制，進(jìn)而影響葉片再生。

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