陳永勝等

摘要：通過(guò)改變花藥接種前的預(yù)處理、培養(yǎng)條件，建立了高效蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)體系，結(jié)果表明：以通蓖5號(hào)為試材，4 ℃預(yù)處理3 d，維生素C浸泡1.5 h，培養(yǎng)基中添加活性炭0.6 g/L、維生素C 200 mg/L，暗培養(yǎng)15 d可獲得高誘導(dǎo)率、低褐化率的蓖麻花藥愈傷組織。

關(guān)鍵詞：蓖麻；花藥；誘導(dǎo)愈傷；防褐化

中圖分類號(hào)： S565.604.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）03-0039-02

蓖麻（Ricinus communis L.）為多年或一年生雙子葉植物，多用于航空航天、化工、醫(yī)藥等行業(yè)，應(yīng)用價(jià)值高、市場(chǎng)潛力大[1]。我國(guó)是蓖麻種植大國(guó)，但蓖麻新品種的開(kāi)發(fā)一直局限于雜交、選擇等傳統(tǒng)育種方式，沒(méi)有將現(xiàn)代育種技術(shù)應(yīng)用于蓖麻育種[2]?；ㄋ幣囵B(yǎng)可獲得蓖麻育種上廣泛應(yīng)用的純系品種，但較低的蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)率、高褐化率一直是限制蓖麻花藥離體培養(yǎng)的主要限制性因素。外植體培養(yǎng)過(guò)程中褐化的原因很多，機(jī)理較為復(fù)雜，多認(rèn)為是培養(yǎng)條件、細(xì)胞死亡或是細(xì)胞中的酚類物質(zhì)變質(zhì)等因素導(dǎo)致[3]。本研究通過(guò)接種不同基因型、維生素C浸泡、改變培養(yǎng)條件（暗培養(yǎng)、添加防褐物），探索適宜蓖麻花藥培養(yǎng)的最適條件，以期有效提高誘導(dǎo)率、降低褐化率，建立高效蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

哲蓖4號(hào)、通蓖5號(hào)、通蓖9號(hào)蓖麻花藥，采自內(nèi)蒙古民族大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)。在溫度較低、日照較弱時(shí)，取健壯無(wú)病的植株上花被尚未張開(kāi)且呈淡黃色的花蕾。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料準(zhǔn)備 本研究根據(jù)黃鳳蘭等研究[4]，取同時(shí)期、質(zhì)優(yōu)的花蕾，流水沖洗30 min，75%乙醇消毒30 s、0.1%HgCl2滅菌2 min，無(wú)菌水沖洗3～5次，轉(zhuǎn)移至鋪有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿。去除花絲，每瓶接種1/3個(gè)花蕾（約230個(gè)），封口后置于培養(yǎng)室培養(yǎng)。在以下的試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，每個(gè)處理接種5瓶，3次重復(fù)。基礎(chǔ)培養(yǎng)基：MS+蔗糖40 g/L+瓊脂7 g/L+脯氨酸600 mg/L+酸性水解酪蛋白600 mg/L+NAA 1.0 mg/L+ZT 3.0 mg/L，pH值=6.0。

1.2.2 蓖麻花藥誘導(dǎo)愈傷防褐化體系篩選

1.2.2.1 不同基因型及低溫預(yù)處理愈傷誘導(dǎo)率和褐化率 取哲蓖4號(hào)、通蓖5號(hào)、通蓖9號(hào)花藥，在相同培養(yǎng)條件下篩選最佳花藥愈傷誘導(dǎo)基因型，并統(tǒng)計(jì)花藥低溫預(yù)處理1、3、5、7、9 d時(shí)的誘導(dǎo)率及褐化率。

1.2.2.2 暗處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以通蓖5號(hào)花藥為材料，接種后暗處理0、5、10、15、20 d，統(tǒng)計(jì)花藥愈傷誘導(dǎo)率及褐化率。

1.2.2.3 維生素C浸泡處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以通蓖5號(hào)花藥為材料，置于100 mg/L 維生素C中分別浸泡0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 h，統(tǒng)計(jì)蓖麻花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率與褐化率。

1.2.2.4 防褐附加物對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以通蓖5號(hào)花藥為材料，分別接種于添加不同濃度活性炭 （0、0.3、0.6、0.9、1.2 g/L）和維生素C （0、100、150、200、250 mg/L）的培養(yǎng)基中，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率及褐化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型及低溫預(yù)處理愈傷誘導(dǎo)率和褐化率

從表1可知，3個(gè)基因型的愈傷誘導(dǎo)率均隨著低溫預(yù)處理時(shí)間的增加呈先增后減的趨勢(shì)，褐化率均呈先減后增的趨勢(shì)，且均在低溫處理3d時(shí)褐化率最低。褐化具有一定的傳播性，故選擇褐化率最低、誘導(dǎo)率最高的最適基因型。綜合表1可知，愈傷組織的褐化率與基因型差異相關(guān)，通蓖5號(hào)在低溫預(yù)處理3 d時(shí)褐化率最低（3.20%），且此時(shí)3個(gè)基因型中通蓖5號(hào)愈傷誘導(dǎo)率也最高（15.94%）。

2.2 暗處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

如表2所示，花藥愈傷誘導(dǎo)率隨暗處理時(shí)間的增加有所提高，愈傷褐化率隨時(shí)間的增加先減后增，且在暗處理15 d時(shí)愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到最大值、褐化率達(dá)到最小值。

2.3 維生素C浸泡處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

如表3所示，維生素C浸泡處理顯著提高了花藥愈傷誘導(dǎo)率，褐化率隨著時(shí)間的增加呈先減后增的趨勢(shì)。浸泡1.5 h時(shí)誘導(dǎo)率最高（28.56%）、褐化率最低（7.42%）。

2.4 防褐附加物對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表4可知，隨著活性炭量的增加，誘導(dǎo)率呈先升后降的趨勢(shì)，褐化率呈先降后升的趨勢(shì)，且濃度為0.6 g/L時(shí)誘導(dǎo)率最高（32.83%）、褐化率最低（11.28%）。培養(yǎng)基中添加維生素C后，誘導(dǎo)率及褐化率與添加活性炭的變化幾乎一致，且濃度為200 mg/L時(shí)獲得最大花藥愈傷誘導(dǎo)率（27.32%）、最小褐化率（8.21%）。蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)過(guò)程見(jiàn)圖1。

3 討論

組織培養(yǎng)過(guò)程中，外植體可能由于內(nèi)分泌紊亂等原因分泌出酚等不利于組織生長(zhǎng)、乃至影響存活的有害成分，導(dǎo)致組織褐化或死亡。故需在不影響愈傷誘導(dǎo)率的前提下，通過(guò)改變培養(yǎng)環(huán)境等因素建立高質(zhì)量愈傷誘導(dǎo)體系。組織離體培養(yǎng)過(guò)程中不同基因型愈傷誘導(dǎo)的能力存在差異，有些組織較難形成愈傷[5]。本研究分析了通蓖5號(hào)、哲蓖4號(hào)、通蓖9號(hào)的愈傷誘導(dǎo)差異，結(jié)果與邵志敏等所分析的結(jié)果[6]一致，通蓖5號(hào)的誘導(dǎo)率及防褐能力均要高于其他2個(gè)品種，且4 ℃遇冷可以有效地降低蓖麻花藥愈傷的褐化率。

本研究又通過(guò)篩選不同的暗處理和維生素C浸泡時(shí)間、添加不同濃度的防褐物（活性炭、維生素C），有效地提高了誘導(dǎo)率、降低了褐化率，成功地建立了高效蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)體系。這與很多研究成果均不謀而合。雷攀登等發(fā)現(xiàn)10 ℃下避光離體培養(yǎng)茶樹(shù)腋芽48 h時(shí)褐變率最低[7]。張文娥等使用維生素C 5 g/L浸泡碧桃莖段30 min能有效抑制碧桃褐化[8]，這與本研究采用維生素C浸泡的效果相近。呂宗友等發(fā)現(xiàn)適當(dāng)添加活性炭、維生素C均能不同程度地提高愈傷誘導(dǎo)率和降低褐化率[9]。韋鳳娟等發(fā)現(xiàn)添加維生素C、PVP、活性炭可有效控制外植體褐化現(xiàn)象[10]。鄭穎等發(fā)現(xiàn)添加活性炭3 g/L可以將臺(tái)灣榿木組織培養(yǎng)的褐化率控制在36.7%～45.6%[11]。蓖麻花藥離體培養(yǎng)的影響因素很多，與其他植物花藥或是其余部位的誘導(dǎo)率相比還較低，還需要進(jìn)一步完善，以建立高效蓖麻花藥再生體系，為培育高產(chǎn)高效的蓖麻良種奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]鄭 鷺，祁建民，陳紹軍，等. 蓖麻遺傳育種進(jìn)展及其在生物能源與醫(yī)藥綜合利用潛勢(shì)[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22（9）：109-113.

[2]曾祥艷，王東雪，馬錦林. 我國(guó)蓖麻良種選育研究現(xiàn)狀及發(fā)展策略[J]. 廣西熱帶農(nóng)業(yè)，2010，131（6）：27-29.

[3]楊亞萍，鄭新強(qiáng). 茶樹(shù)組織培養(yǎng)中的褐化控制研究[J]. 茶葉，2013，39（1）：3-7.

[4]黃鳳蘭，薩日娜，孟凡娟，等. 蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)的研究[J]. 作物雜志，2009（6）：59-63.

[5]宋欽虎，郭新梅，裴玉賀，等. 抑制玉米幼胚愈傷組織褐化的研究[J]. 農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2012，2（5）：24-28.

[6]邵志敏，陳永勝，黃鳳蘭，等. 低溫預(yù)處理與光照條件對(duì)蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，27（2）：189-193.

[7]雷攀登，吳 瓊，徐奕鼎，等. 茶樹(shù)腋芽離體培養(yǎng)中的褐化控制研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（7）：190-193.

[8]張文娥，潘學(xué)軍，楊仕國(guó)，等. 碧桃組織培養(yǎng)中褐化及其抑制研究[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（1）：11-12.

[9]呂宗友，蘇衍菁，趙國(guó)琦，等. 不同防褐化措施對(duì)蘇丹草愈傷誘導(dǎo)以及抗褐化的效果研究[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（3）：174-181.

[10]韋鳳娟，廖克波，楊 梅，等. 擎天樹(shù)組培外植體消毒與褐化抑制的研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27（31）：18-22.

[11]鄭 穎，秦紅玫，黎云祥. 臺(tái)灣榿木組織培養(yǎng)中污染和褐化的防止[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（2）：64-65，117.

摘要：通過(guò)改變花藥接種前的預(yù)處理、培養(yǎng)條件，建立了高效蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)體系，結(jié)果表明：以通蓖5號(hào)為試材，4 ℃預(yù)處理3 d，維生素C浸泡1.5 h，培養(yǎng)基中添加活性炭0.6 g/L、維生素C 200 mg/L，暗培養(yǎng)15 d可獲得高誘導(dǎo)率、低褐化率的蓖麻花藥愈傷組織。

關(guān)鍵詞：蓖麻；花藥；誘導(dǎo)愈傷；防褐化

中圖分類號(hào)： S565.604.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）03-0039-02

蓖麻（Ricinus communis L.）為多年或一年生雙子葉植物，多用于航空航天、化工、醫(yī)藥等行業(yè)，應(yīng)用價(jià)值高、市場(chǎng)潛力大[1]。我國(guó)是蓖麻種植大國(guó)，但蓖麻新品種的開(kāi)發(fā)一直局限于雜交、選擇等傳統(tǒng)育種方式，沒(méi)有將現(xiàn)代育種技術(shù)應(yīng)用于蓖麻育種[2]?；ㄋ幣囵B(yǎng)可獲得蓖麻育種上廣泛應(yīng)用的純系品種，但較低的蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)率、高褐化率一直是限制蓖麻花藥離體培養(yǎng)的主要限制性因素。外植體培養(yǎng)過(guò)程中褐化的原因很多，機(jī)理較為復(fù)雜，多認(rèn)為是培養(yǎng)條件、細(xì)胞死亡或是細(xì)胞中的酚類物質(zhì)變質(zhì)等因素導(dǎo)致[3]。本研究通過(guò)接種不同基因型、維生素C浸泡、改變培養(yǎng)條件（暗培養(yǎng)、添加防褐物），探索適宜蓖麻花藥培養(yǎng)的最適條件，以期有效提高誘導(dǎo)率、降低褐化率，建立高效蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

哲蓖4號(hào)、通蓖5號(hào)、通蓖9號(hào)蓖麻花藥，采自內(nèi)蒙古民族大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)。在溫度較低、日照較弱時(shí)，取健壯無(wú)病的植株上花被尚未張開(kāi)且呈淡黃色的花蕾。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料準(zhǔn)備 本研究根據(jù)黃鳳蘭等研究[4]，取同時(shí)期、質(zhì)優(yōu)的花蕾，流水沖洗30 min，75%乙醇消毒30 s、0.1%HgCl2滅菌2 min，無(wú)菌水沖洗3～5次，轉(zhuǎn)移至鋪有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿。去除花絲，每瓶接種1/3個(gè)花蕾（約230個(gè)），封口后置于培養(yǎng)室培養(yǎng)。在以下的試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，每個(gè)處理接種5瓶，3次重復(fù)?；A(chǔ)培養(yǎng)基：MS+蔗糖40 g/L+瓊脂7 g/L+脯氨酸600 mg/L+酸性水解酪蛋白600 mg/L+NAA 1.0 mg/L+ZT 3.0 mg/L，pH值=6.0。

1.2.2 蓖麻花藥誘導(dǎo)愈傷防褐化體系篩選

1.2.2.1 不同基因型及低溫預(yù)處理愈傷誘導(dǎo)率和褐化率 取哲蓖4號(hào)、通蓖5號(hào)、通蓖9號(hào)花藥，在相同培養(yǎng)條件下篩選最佳花藥愈傷誘導(dǎo)基因型，并統(tǒng)計(jì)花藥低溫預(yù)處理1、3、5、7、9 d時(shí)的誘導(dǎo)率及褐化率。

1.2.2.2 暗處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以通蓖5號(hào)花藥為材料，接種后暗處理0、5、10、15、20 d，統(tǒng)計(jì)花藥愈傷誘導(dǎo)率及褐化率。

1.2.2.3 維生素C浸泡處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以通蓖5號(hào)花藥為材料，置于100 mg/L 維生素C中分別浸泡0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 h，統(tǒng)計(jì)蓖麻花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率與褐化率。

1.2.2.4 防褐附加物對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以通蓖5號(hào)花藥為材料，分別接種于添加不同濃度活性炭 （0、0.3、0.6、0.9、1.2 g/L）和維生素C （0、100、150、200、250 mg/L）的培養(yǎng)基中，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率及褐化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型及低溫預(yù)處理愈傷誘導(dǎo)率和褐化率

從表1可知，3個(gè)基因型的愈傷誘導(dǎo)率均隨著低溫預(yù)處理時(shí)間的增加呈先增后減的趨勢(shì)，褐化率均呈先減后增的趨勢(shì)，且均在低溫處理3d時(shí)褐化率最低。褐化具有一定的傳播性，故選擇褐化率最低、誘導(dǎo)率最高的最適基因型。綜合表1可知，愈傷組織的褐化率與基因型差異相關(guān)，通蓖5號(hào)在低溫預(yù)處理3 d時(shí)褐化率最低（3.20%），且此時(shí)3個(gè)基因型中通蓖5號(hào)愈傷誘導(dǎo)率也最高（15.94%）。

2.2 暗處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

如表2所示，花藥愈傷誘導(dǎo)率隨暗處理時(shí)間的增加有所提高，愈傷褐化率隨時(shí)間的增加先減后增，且在暗處理15 d時(shí)愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到最大值、褐化率達(dá)到最小值。

2.3 維生素C浸泡處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

如表3所示，維生素C浸泡處理顯著提高了花藥愈傷誘導(dǎo)率，褐化率隨著時(shí)間的增加呈先減后增的趨勢(shì)。浸泡1.5 h時(shí)誘導(dǎo)率最高（28.56%）、褐化率最低（7.42%）。

2.4 防褐附加物對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表4可知，隨著活性炭量的增加，誘導(dǎo)率呈先升后降的趨勢(shì)，褐化率呈先降后升的趨勢(shì)，且濃度為0.6 g/L時(shí)誘導(dǎo)率最高（32.83%）、褐化率最低（11.28%）。培養(yǎng)基中添加維生素C后，誘導(dǎo)率及褐化率與添加活性炭的變化幾乎一致，且濃度為200 mg/L時(shí)獲得最大花藥愈傷誘導(dǎo)率（27.32%）、最小褐化率（8.21%）。蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)過(guò)程見(jiàn)圖1。

3 討論

組織培養(yǎng)過(guò)程中，外植體可能由于內(nèi)分泌紊亂等原因分泌出酚等不利于組織生長(zhǎng)、乃至影響存活的有害成分，導(dǎo)致組織褐化或死亡。故需在不影響愈傷誘導(dǎo)率的前提下，通過(guò)改變培養(yǎng)環(huán)境等因素建立高質(zhì)量愈傷誘導(dǎo)體系。組織離體培養(yǎng)過(guò)程中不同基因型愈傷誘導(dǎo)的能力存在差異，有些組織較難形成愈傷[5]。本研究分析了通蓖5號(hào)、哲蓖4號(hào)、通蓖9號(hào)的愈傷誘導(dǎo)差異，結(jié)果與邵志敏等所分析的結(jié)果[6]一致，通蓖5號(hào)的誘導(dǎo)率及防褐能力均要高于其他2個(gè)品種，且4 ℃遇冷可以有效地降低蓖麻花藥愈傷的褐化率。

本研究又通過(guò)篩選不同的暗處理和維生素C浸泡時(shí)間、添加不同濃度的防褐物（活性炭、維生素C），有效地提高了誘導(dǎo)率、降低了褐化率，成功地建立了高效蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)體系。這與很多研究成果均不謀而合。雷攀登等發(fā)現(xiàn)10 ℃下避光離體培養(yǎng)茶樹(shù)腋芽48 h時(shí)褐變率最低[7]。張文娥等使用維生素C 5 g/L浸泡碧桃莖段30 min能有效抑制碧桃褐化[8]，這與本研究采用維生素C浸泡的效果相近。呂宗友等發(fā)現(xiàn)適當(dāng)添加活性炭、維生素C均能不同程度地提高愈傷誘導(dǎo)率和降低褐化率[9]。韋鳳娟等發(fā)現(xiàn)添加維生素C、PVP、活性炭可有效控制外植體褐化現(xiàn)象[10]。鄭穎等發(fā)現(xiàn)添加活性炭3 g/L可以將臺(tái)灣榿木組織培養(yǎng)的褐化率控制在36.7%～45.6%[11]。蓖麻花藥離體培養(yǎng)的影響因素很多，與其他植物花藥或是其余部位的誘導(dǎo)率相比還較低，還需要進(jìn)一步完善，以建立高效蓖麻花藥再生體系，為培育高產(chǎn)高效的蓖麻良種奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]鄭 鷺，祁建民，陳紹軍，等. 蓖麻遺傳育種進(jìn)展及其在生物能源與醫(yī)藥綜合利用潛勢(shì)[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22（9）：109-113.

[2]曾祥艷，王東雪，馬錦林. 我國(guó)蓖麻良種選育研究現(xiàn)狀及發(fā)展策略[J]. 廣西熱帶農(nóng)業(yè)，2010，131（6）：27-29.

[3]楊亞萍，鄭新強(qiáng). 茶樹(shù)組織培養(yǎng)中的褐化控制研究[J]. 茶葉，2013，39（1）：3-7.

[4]黃鳳蘭，薩日娜，孟凡娟，等. 蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)的研究[J]. 作物雜志，2009（6）：59-63.

[5]宋欽虎，郭新梅，裴玉賀，等. 抑制玉米幼胚愈傷組織褐化的研究[J]. 農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2012，2（5）：24-28.

[6]邵志敏，陳永勝，黃鳳蘭，等. 低溫預(yù)處理與光照條件對(duì)蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，27（2）：189-193.

[7]雷攀登，吳 瓊，徐奕鼎，等. 茶樹(shù)腋芽離體培養(yǎng)中的褐化控制研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（7）：190-193.

[8]張文娥，潘學(xué)軍，楊仕國(guó)，等. 碧桃組織培養(yǎng)中褐化及其抑制研究[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（1）：11-12.

[9]呂宗友，蘇衍菁，趙國(guó)琦，等. 不同防褐化措施對(duì)蘇丹草愈傷誘導(dǎo)以及抗褐化的效果研究[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（3）：174-181.

[10]韋鳳娟，廖克波，楊 梅，等. 擎天樹(shù)組培外植體消毒與褐化抑制的研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27（31）：18-22.

[11]鄭 穎，秦紅玫，黎云祥. 臺(tái)灣榿木組織培養(yǎng)中污染和褐化的防止[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（2）：64-65，117.

摘要：通過(guò)改變花藥接種前的預(yù)處理、培養(yǎng)條件，建立了高效蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)體系，結(jié)果表明：以通蓖5號(hào)為試材，4 ℃預(yù)處理3 d，維生素C浸泡1.5 h，培養(yǎng)基中添加活性炭0.6 g/L、維生素C 200 mg/L，暗培養(yǎng)15 d可獲得高誘導(dǎo)率、低褐化率的蓖麻花藥愈傷組織。

關(guān)鍵詞：蓖麻；花藥；誘導(dǎo)愈傷；防褐化

中圖分類號(hào)： S565.604.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）03-0039-02

蓖麻（Ricinus communis L.）為多年或一年生雙子葉植物，多用于航空航天、化工、醫(yī)藥等行業(yè)，應(yīng)用價(jià)值高、市場(chǎng)潛力大[1]。我國(guó)是蓖麻種植大國(guó)，但蓖麻新品種的開(kāi)發(fā)一直局限于雜交、選擇等傳統(tǒng)育種方式，沒(méi)有將現(xiàn)代育種技術(shù)應(yīng)用于蓖麻育種[2]?；ㄋ幣囵B(yǎng)可獲得蓖麻育種上廣泛應(yīng)用的純系品種，但較低的蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)率、高褐化率一直是限制蓖麻花藥離體培養(yǎng)的主要限制性因素。外植體培養(yǎng)過(guò)程中褐化的原因很多，機(jī)理較為復(fù)雜，多認(rèn)為是培養(yǎng)條件、細(xì)胞死亡或是細(xì)胞中的酚類物質(zhì)變質(zhì)等因素導(dǎo)致[3]。本研究通過(guò)接種不同基因型、維生素C浸泡、改變培養(yǎng)條件（暗培養(yǎng)、添加防褐物），探索適宜蓖麻花藥培養(yǎng)的最適條件，以期有效提高誘導(dǎo)率、降低褐化率，建立高效蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

哲蓖4號(hào)、通蓖5號(hào)、通蓖9號(hào)蓖麻花藥，采自內(nèi)蒙古民族大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)。在溫度較低、日照較弱時(shí)，取健壯無(wú)病的植株上花被尚未張開(kāi)且呈淡黃色的花蕾。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料準(zhǔn)備 本研究根據(jù)黃鳳蘭等研究[4]，取同時(shí)期、質(zhì)優(yōu)的花蕾，流水沖洗30 min，75%乙醇消毒30 s、0.1%HgCl2滅菌2 min，無(wú)菌水沖洗3～5次，轉(zhuǎn)移至鋪有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿。去除花絲，每瓶接種1/3個(gè)花蕾（約230個(gè)），封口后置于培養(yǎng)室培養(yǎng)。在以下的試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，每個(gè)處理接種5瓶，3次重復(fù)?；A(chǔ)培養(yǎng)基：MS+蔗糖40 g/L+瓊脂7 g/L+脯氨酸600 mg/L+酸性水解酪蛋白600 mg/L+NAA 1.0 mg/L+ZT 3.0 mg/L，pH值=6.0。

1.2.2 蓖麻花藥誘導(dǎo)愈傷防褐化體系篩選

1.2.2.1 不同基因型及低溫預(yù)處理愈傷誘導(dǎo)率和褐化率 取哲蓖4號(hào)、通蓖5號(hào)、通蓖9號(hào)花藥，在相同培養(yǎng)條件下篩選最佳花藥愈傷誘導(dǎo)基因型，并統(tǒng)計(jì)花藥低溫預(yù)處理1、3、5、7、9 d時(shí)的誘導(dǎo)率及褐化率。

1.2.2.2 暗處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以通蓖5號(hào)花藥為材料，接種后暗處理0、5、10、15、20 d，統(tǒng)計(jì)花藥愈傷誘導(dǎo)率及褐化率。

1.2.2.3 維生素C浸泡處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以通蓖5號(hào)花藥為材料，置于100 mg/L 維生素C中分別浸泡0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 h，統(tǒng)計(jì)蓖麻花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率與褐化率。

1.2.2.4 防褐附加物對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以通蓖5號(hào)花藥為材料，分別接種于添加不同濃度活性炭 （0、0.3、0.6、0.9、1.2 g/L）和維生素C （0、100、150、200、250 mg/L）的培養(yǎng)基中，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率及褐化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型及低溫預(yù)處理愈傷誘導(dǎo)率和褐化率

從表1可知，3個(gè)基因型的愈傷誘導(dǎo)率均隨著低溫預(yù)處理時(shí)間的增加呈先增后減的趨勢(shì)，褐化率均呈先減后增的趨勢(shì)，且均在低溫處理3d時(shí)褐化率最低。褐化具有一定的傳播性，故選擇褐化率最低、誘導(dǎo)率最高的最適基因型。綜合表1可知，愈傷組織的褐化率與基因型差異相關(guān)，通蓖5號(hào)在低溫預(yù)處理3 d時(shí)褐化率最低（3.20%），且此時(shí)3個(gè)基因型中通蓖5號(hào)愈傷誘導(dǎo)率也最高（15.94%）。

2.2 暗處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

如表2所示，花藥愈傷誘導(dǎo)率隨暗處理時(shí)間的增加有所提高，愈傷褐化率隨時(shí)間的增加先減后增，且在暗處理15 d時(shí)愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到最大值、褐化率達(dá)到最小值。

2.3 維生素C浸泡處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

如表3所示，維生素C浸泡處理顯著提高了花藥愈傷誘導(dǎo)率，褐化率隨著時(shí)間的增加呈先減后增的趨勢(shì)。浸泡1.5 h時(shí)誘導(dǎo)率最高（28.56%）、褐化率最低（7.42%）。

2.4 防褐附加物對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表4可知，隨著活性炭量的增加，誘導(dǎo)率呈先升后降的趨勢(shì)，褐化率呈先降后升的趨勢(shì)，且濃度為0.6 g/L時(shí)誘導(dǎo)率最高（32.83%）、褐化率最低（11.28%）。培養(yǎng)基中添加維生素C后，誘導(dǎo)率及褐化率與添加活性炭的變化幾乎一致，且濃度為200 mg/L時(shí)獲得最大花藥愈傷誘導(dǎo)率（27.32%）、最小褐化率（8.21%）。蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)過(guò)程見(jiàn)圖1。

3 討論

組織培養(yǎng)過(guò)程中，外植體可能由于內(nèi)分泌紊亂等原因分泌出酚等不利于組織生長(zhǎng)、乃至影響存活的有害成分，導(dǎo)致組織褐化或死亡。故需在不影響愈傷誘導(dǎo)率的前提下，通過(guò)改變培養(yǎng)環(huán)境等因素建立高質(zhì)量愈傷誘導(dǎo)體系。組織離體培養(yǎng)過(guò)程中不同基因型愈傷誘導(dǎo)的能力存在差異，有些組織較難形成愈傷[5]。本研究分析了通蓖5號(hào)、哲蓖4號(hào)、通蓖9號(hào)的愈傷誘導(dǎo)差異，結(jié)果與邵志敏等所分析的結(jié)果[6]一致，通蓖5號(hào)的誘導(dǎo)率及防褐能力均要高于其他2個(gè)品種，且4 ℃遇冷可以有效地降低蓖麻花藥愈傷的褐化率。

本研究又通過(guò)篩選不同的暗處理和維生素C浸泡時(shí)間、添加不同濃度的防褐物（活性炭、維生素C），有效地提高了誘導(dǎo)率、降低了褐化率，成功地建立了高效蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)體系。這與很多研究成果均不謀而合。雷攀登等發(fā)現(xiàn)10 ℃下避光離體培養(yǎng)茶樹(shù)腋芽48 h時(shí)褐變率最低[7]。張文娥等使用維生素C 5 g/L浸泡碧桃莖段30 min能有效抑制碧桃褐化[8]，這與本研究采用維生素C浸泡的效果相近。呂宗友等發(fā)現(xiàn)適當(dāng)添加活性炭、維生素C均能不同程度地提高愈傷誘導(dǎo)率和降低褐化率[9]。韋鳳娟等發(fā)現(xiàn)添加維生素C、PVP、活性炭可有效控制外植體褐化現(xiàn)象[10]。鄭穎等發(fā)現(xiàn)添加活性炭3 g/L可以將臺(tái)灣榿木組織培養(yǎng)的褐化率控制在36.7%～45.6%[11]。蓖麻花藥離體培養(yǎng)的影響因素很多，與其他植物花藥或是其余部位的誘導(dǎo)率相比還較低，還需要進(jìn)一步完善，以建立高效蓖麻花藥再生體系，為培育高產(chǎn)高效的蓖麻良種奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]鄭 鷺，祁建民，陳紹軍，等. 蓖麻遺傳育種進(jìn)展及其在生物能源與醫(yī)藥綜合利用潛勢(shì)[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22（9）：109-113.

[2]曾祥艷，王東雪，馬錦林. 我國(guó)蓖麻良種選育研究現(xiàn)狀及發(fā)展策略[J]. 廣西熱帶農(nóng)業(yè)，2010，131（6）：27-29.

[3]楊亞萍，鄭新強(qiáng). 茶樹(shù)組織培養(yǎng)中的褐化控制研究[J]. 茶葉，2013，39（1）：3-7.

[4]黃鳳蘭，薩日娜，孟凡娟，等. 蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)的研究[J]. 作物雜志，2009（6）：59-63.

[5]宋欽虎，郭新梅，裴玉賀，等. 抑制玉米幼胚愈傷組織褐化的研究[J]. 農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2012，2（5）：24-28.

[6]邵志敏，陳永勝，黃鳳蘭，等. 低溫預(yù)處理與光照條件對(duì)蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，27（2）：189-193.

[7]雷攀登，吳 瓊，徐奕鼎，等. 茶樹(shù)腋芽離體培養(yǎng)中的褐化控制研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（7）：190-193.

[8]張文娥，潘學(xué)軍，楊仕國(guó)，等. 碧桃組織培養(yǎng)中褐化及其抑制研究[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（1）：11-12.

[9]呂宗友，蘇衍菁，趙國(guó)琦，等. 不同防褐化措施對(duì)蘇丹草愈傷誘導(dǎo)以及抗褐化的效果研究[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（3）：174-181.

[10]韋鳳娟，廖克波，楊 梅，等. 擎天樹(shù)組培外植體消毒與褐化抑制的研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27（31）：18-22.

[11]鄭 穎，秦紅玫，黎云祥. 臺(tái)灣榿木組織培養(yǎng)中污染和褐化的防止[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（2）：64-65，117.