羅君琴，徐建國，王 平，柯甫志，聶振朋

(浙江省柑橘研究所，浙江 黃巖 318020)

花藥離體培養(yǎng)技術(shù)在作物育種和遺傳進(jìn)化研究中具有重要的理論和應(yīng)用價值，利用該技術(shù)可獲得一定比例的單倍體或異倍體材料，有助于在短期內(nèi)創(chuàng)造新的不同基因型的遺傳材料，豐富作物育種原始種質(zhì)資源，有助于縮短育種進(jìn)程［1-11］。

本研究選擇柑橘單核中晚期花藥為離體培養(yǎng)外植體［7-8］，通過比較不同柑橘品種［2］、培養(yǎng)基外源激素配方［3，8-9，12-15］、外植體低溫預(yù)處理［3，7-8，12］等因子對花藥離體愈傷誘導(dǎo)的影響，研究柑橘花藥離體愈傷誘導(dǎo)及無菌再生體系的建立，以期為今后全面開展柑橘花藥 (花粉)離體培養(yǎng)奠定一定的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以浙江省柑橘研究所山地試驗站品種資源圃及本部試驗場的北京檸檬 (Citrus limon Burm.f.)、439桔橙 (reticulata× sinensis)、早桔 (Citrus compressa Tanaka)、四季桔 (madurensis Lour.)和長壽金柑(Fortunella obovata Tanaka)5個柑橘品種為試材，以柑橘現(xiàn)蕾期花粉處于單核中晚期時的幼花蕾花藥為離體培養(yǎng)對象。

1.2 外植體消毒

先將柑橘幼花蕾在洗滌劑中浸泡15～30 min，流水沖洗20～30 min，在無菌條件下，將花蕾進(jìn)行75%乙醇10～15 s+0.1% 升汞10 min 滅菌處理，無菌水沖洗3～5 次后，在體視顯微鏡下切除花絲，小心切取花藥接種到各誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，接種時注意避免花柱、花冠、子房等其他組織器官混入。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 不同柑橘品種花藥離體愈傷誘導(dǎo)比較

試驗比較北京檸檬等5種柑橘花藥在相同培養(yǎng)條件下離體愈傷誘導(dǎo)效果。每個品種離體接種500個以上花藥，花藥接種后每隔1 周觀察愈傷形成情況，記錄各品種花藥最早愈傷出現(xiàn)時間，3個月后統(tǒng)計產(chǎn)生愈傷接種外植體比例。

1.3.2 外源激素對柑橘花藥愈傷誘導(dǎo)的影響

以MT 基本培養(yǎng)基中添加6-BA，TDZ，2，4-D為考查因子，利用正交設(shè)計篩選花藥愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基外源激素配方。試驗以北京檸檬花藥為接種外植體，采用L9(33)正交方案，設(shè)9個處理組合，每個處理組合接種400～500個花藥，培養(yǎng)3個月后，觀察記錄花藥愈傷誘導(dǎo)情況，統(tǒng)計分析外源激素對花藥愈傷誘導(dǎo)的影響。

1.3.3 低溫預(yù)處理對柑橘花藥愈傷誘導(dǎo)的影響

柑橘花藥外植體接種于相同愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，先分別在 (6 ± 2)℃低溫暗培養(yǎng)0，5，10，15，20 d，再轉(zhuǎn)入23～25℃條件暗培養(yǎng)。每處理400～500個花藥，3個月后觀察統(tǒng)計產(chǎn)生愈傷外植體比例。以上各處理基本培養(yǎng)基均為MT+30～40 g·L-1蔗糖+8 g·L-1瓊脂，pH 值5.8，培養(yǎng)溫度無特指均為23～25℃，光照條件為愈傷產(chǎn)生前為暗培養(yǎng)，愈傷形成后在2 000～2 500 lx 下12 h·d-1光培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同柑橘品種花藥離體愈傷誘導(dǎo)比較

從表1 可知，北京檸檬花藥愈傷較易誘導(dǎo)，花藥愈傷最初產(chǎn)生所需時間在5個柑橘品種中最短，5 周即肉眼可見愈傷產(chǎn)生，接種后花藥產(chǎn)生愈傷外植體比例極顯著高于其他幾種，高達(dá)69.97%。439 桔橙、長壽金柑、四季桔花藥愈傷誘導(dǎo)較難，花藥接種3個月后外植體愈傷比率僅分別為1.90%，0.33%和0.20%。早桔接種后3個月內(nèi)未能獲得花藥愈傷，接種23 周后才有愈傷產(chǎn)生，其花藥愈傷誘導(dǎo)在5個供試品種中最難。柑橘花藥離體接種及所獲誘導(dǎo)愈傷的部分組培圖片如圖1所示。

表1 5個柑橘品種花藥離體愈傷誘導(dǎo)

2.2 不同外源激素對柑橘花藥愈傷的誘導(dǎo)

圖1 幾種花藥離體培養(yǎng)形成的愈傷組織

北京檸檬花藥離體培養(yǎng)3個月后，觀察比較各處理培養(yǎng)基對花藥愈傷誘導(dǎo)的影響 (表2)。對6-BA，TDZ 和2，4-D 3個水平、9個組合試驗結(jié)果進(jìn)行極差分析表明，3種外源激素對花藥愈傷誘導(dǎo)的影響作用依次為2，4-D ＞TDZ ＞6-BA;對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析表明，2，4-D (F=10.34)，TDZ (F=1.63)，6-BA (F=0.29)等因子對北京檸檬花藥愈傷誘導(dǎo)影響均未達(dá)顯著水平。結(jié)合表2直觀分析，試驗可優(yōu)選處理2 組合培養(yǎng)基用于柑橘花藥愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)。

表2 外源激素對北京檸檬花藥愈傷誘導(dǎo)的影響

2.3 低溫預(yù)處理對柑橘花藥愈傷誘導(dǎo)的影響

北京檸檬、439 桔橙花藥接種前分別在 (6 ±2)℃低溫暗培養(yǎng)0，5，10，15，20 d，各處理花藥接種3個月后，進(jìn)行外植體產(chǎn)生愈傷比例觀察(圖2)。

圖2 低溫預(yù)處理時間對柑橘花藥愈傷誘導(dǎo)的影響

由圖2 可知，2種柑橘在 (6 ±2)℃低溫預(yù)處理5～10 d，花藥外植體愈傷誘導(dǎo)比率均高于未低溫預(yù)處理及低溫預(yù)處理超過15 d 的處理。適當(dāng)時長的低溫預(yù)處理有助于柑橘花藥離體愈傷誘導(dǎo)。

3 小結(jié)和討論

相同誘導(dǎo)培養(yǎng)基和光溫控制條件下，5個供試柑橘品種花藥愈傷誘導(dǎo)差異很大，一定程度上反映出柑橘花藥誘導(dǎo)受各品種不同的遺傳因子直接影響。品種選擇是柑橘花藥愈傷誘導(dǎo)成敗的關(guān)鍵。結(jié)合鄭振光等［8］的柑橘花藥培養(yǎng)研究表明，檸檬類、橙類花藥的離體愈傷誘導(dǎo)相對較易，寬皮柑橘類栽培品種花藥愈傷誘導(dǎo)較難。試驗中的長壽金柑、四季桔均是金柑與寬皮柑橘的雜種后代，兩品種的花藥離體愈傷最初產(chǎn)生所需時間及花藥接種3個月后的外植體愈傷比例很接近，這也反映出遺傳基因決定柑橘花藥離體愈傷誘導(dǎo)難易程度。

外源激素是影響花藥離體培養(yǎng)的關(guān)鍵因素。不同果樹對不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類、濃度的反應(yīng)不同，需在試驗中找到各自適合的組合配方。目前國內(nèi)外有關(guān)柑橘花藥離體愈傷誘導(dǎo)技術(shù)報道相對較少，可直接借鑒的培養(yǎng)基配方技術(shù)參數(shù)相關(guān)資料更少。利用正交設(shè)計試驗研究柑橘花藥愈傷誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基激素組合，可快速有效地篩選、判斷培養(yǎng)基添加適用外源激素種類及濃度范圍。2，4-D，TDZ和BA 是植物組培中愈傷誘導(dǎo)的重要添加激素［8，13，15］，細(xì)胞分裂素/生長素比值及絕對濃度 控制接種外植體的脫分化及再分化形態(tài)建成的方向，直接影響花藥外植體愈傷誘導(dǎo)結(jié)果。本研究通過正交試驗結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，6-BA，TDZ，2，4-D 3種生長調(diào)節(jié)劑對供試柑橘花藥離體愈傷誘導(dǎo)的影響主次順序為2，4-D ＞TDZ ＞6-BA，(BA+TDZ)/2，4-D 比值在3～4∶1 范圍內(nèi)可較大程度地促進(jìn)柑橘花藥離體愈傷誘導(dǎo)。更易促進(jìn)柑橘花藥愈傷誘導(dǎo)的細(xì)胞分裂素/生長素比值是否也在該范圍內(nèi)，有待進(jìn)一步試驗。

柑橘花藥接種前期在 (6 ±2)℃低溫預(yù)培養(yǎng)5～10 d 有利于柑橘花藥離體培養(yǎng)后的愈傷誘導(dǎo)。本試驗結(jié)果與陳力耕等［7-8，12］適當(dāng)時長的低溫預(yù)處理促進(jìn)花藥愈傷誘導(dǎo)的研究結(jié)果一致。目前針對不同作物物種花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)各實驗室所采用的低溫預(yù)處理絕對溫度不盡相同，宜根據(jù)不同低溫試驗獲取各自的適宜處理時長。試驗中還發(fā)現(xiàn)，不經(jīng)低溫預(yù)處理的對照組檸檬花藥外植體誘導(dǎo)率仍可達(dá)48.1%，一定程度上說明低溫預(yù)處理非花藥愈傷誘導(dǎo)必不可少的決定性技術(shù)因子。低溫預(yù)處理促成愈傷組織形成，可能與其在不影響花藥內(nèi)花粉正常生長前提下，延緩離體培養(yǎng)的花藥熟化，為花藥吸收外源激素盡快促成生殖生長向營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)變有關(guān)。

目前實驗室已成功誘導(dǎo)獲取北京檸檬、439 桔橙、四季桔等4個柑橘品種花藥愈傷組織，并根據(jù)愈傷發(fā)生部位不同，分類繼代增殖及保存，下階段可進(jìn)一步開展愈傷材料倍性檢測、胚狀體或再生芽誘導(dǎo)等試驗研究。

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