何 羽

（貴州省畢節(jié)市食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 畢節(jié) 551700）

桂蒲腎清膠囊是由訶子、人工牛黃、三七等12味中藥組方的復(fù)方制劑，具有清熱利濕解毒、化瘀通淋止痛等功效。桂蒲腎清膠囊收載于《國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編·內(nèi)科腎系分冊》[1]，三七為該方中主藥，原標(biāo)準(zhǔn)只對其作定了性鑒別而沒有含量測定方法，2010年版《中國藥典（一部）》對三七測定了人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1三者的總量[2]。由于人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1吸收波長在紫外末端區(qū)，含量測定時(shí)各成分相互干擾嚴(yán)重，人參皂苷Rb1和三七皂苷R1不易與基線分離，而人參皂苷Rg1為三七的主要成分，與基線和各雜質(zhì)峰分離較好。為此，采用人參皂苷Rg1為三七的含量控制指標(biāo)，取得了滿意的結(jié)果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

SPD－10AVP型高效液相色譜儀（日本島津公司），LC－10ATVP型檢測器；Waters e2695型高效液相色譜儀，2998檢測器；AG－135型電子天平（日本島津公司）。乙腈（色譜純，江蘇漢邦科枝有限公司）；甲醇（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心）；冰醋酸（天津市永達(dá)化學(xué)試劑有限公司）；水為重蒸水，自制；人參皂苷Rg1對照品（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號為 110754－200421）；桂蒲腎清膠囊（市場購買，批號為20100501，20100811，20100924）。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：SunfireC18柱（200mm ×4．6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈 －0．05% 磷酸水溶液（25 ∶75）[4]；流速：1．0 mL ／min；檢測波長：203 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。在此條件下，樣品中人參皂苷Rg1與其他雜質(zhì)峰均能達(dá)到與基線分離，陰性無干擾，見圖1。

2．2 溶液制備

圖1 高效液相色譜圖

精密稱取經(jīng)60℃減壓干燥4 h的人參皂苷Rg1對照品14．52 mg，置100 mL的容量瓶中，加甲醇使其溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液（每1 mL含人參皂苷Rg10．145 2 mg）。

取裝量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取1．0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0．45μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。取缺三七的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn)：精密吸取對照品溶液、陰性對照品溶液及供試品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件注入高效液相色譜儀。結(jié)果在此色譜條件下，在與人參皂苷Rg1峰相同的保留時(shí)間處，陰性樣品無峰出現(xiàn)，說明陰性對照品溶液無干擾，見圖1。

線性關(guān)系考察：精密稱取經(jīng)60℃減壓干燥4 h的人參皂苷Rg1對照品10．89 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇使其溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品貯備液（每1mL含人參皂苷Rg10．435 6 mg）。精密量取對照品貯備液精密吸取 1，2，3，4，5，6 mL，置 10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含人參皂苷Rg143．56，87．12，130．68，174．24，217．80，261．36 μg 的系列對照品溶液，分別精密吸取上述系列對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件測定峰面積，記錄色譜圖，以對照品進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積值（Y）為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y＝472 915．125 28X＋1 269．600 00，R2＝0．999 14（n＝6）。將一樣品的峰面積代入上兩式，結(jié)果RSD為0．33%，可認(rèn)為截距為零，可用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量。結(jié)果表明，人參皂苷Rg1進(jìn)樣量在0．435 6 ～2．613 6 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：精密吸取人參皂苷Rg1對照品溶液（質(zhì)量濃度為 0．145 2 g／L）10 μL，平行進(jìn)樣 6 次，結(jié)果的RSD為 0．32%，表明儀器精密度良好。取同一對照品溶液，分別在不同日期、不同分析人員、不同設(shè)備分別進(jìn)行測定。結(jié)果不同日期、不同分析人員、不同設(shè)備測得的含量RSD為1．17%，表明該含量測定方法的中間精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液各10 μL，在室溫下每隔2 h重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果每隔2 h進(jìn)樣的RSD為2．06%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批次的樣品，依法制備5份供試品溶液，按擬訂色譜條件測定含量。結(jié)果表明，該樣品的平均含量為3．397 3 mg／g，RSD為 0．81% （n＝5），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的同一批樣品（人參皂苷Rg1含量為 3．200 2 mg ／g）0．5 g，9 份，精密稱定，將相當(dāng)于對照品溶液總含量的80%，100%，120%質(zhì)量濃度人參皂苷Rg1加入人參皂苷 Rg1貯備液（0．24 g ／L）4，5，6 mL，依法制備成供試品溶液，按照擬訂色譜條件測定。結(jié)果見表1。

2．4 樣品含量測定

依法測定3批樣品，每批測定3次，結(jié)果見表2。從樣品中人參皂苷Rg1測定結(jié)果可知，平均含量為每粒1．625 9 mg，但考慮到生產(chǎn)或貯存過程對藥品的影響，以本品每粒含人參皂苷Rg1的含量限度按理論下浮25%計(jì)為1．625 9 mg×（1－25%）＝1．219 4 mg／粒，與現(xiàn)行藥品限量規(guī)定要求相符，即含人參皂苷Rg1的含量暫訂為含三七以人參皂苷Rg1計(jì)不得低于1．25mg／粒。

3 討論

提取方法考察：取本品2份，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量；一份超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz）60 min；另一份回流提取60 min，放冷，再稱定質(zhì)量。用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0．45 μm微孔濾膜濾過，取10 μL按擬訂色譜條件注入高效液相色譜儀進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果熱回流提取60 min人參皂苷Rg1含量為3．926 1 mg／g，超聲提取60 min人參皂苷Rg1含量為3．188 0 mg／g，說明用甲醇熱回流提取60 min較超聲處理60 min人參皂苷Rg1的含量高。因此，本樣品的提取方法選擇熱回流提取。

表1 人參皂苷Rg1加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）

提取時(shí)間考察：取本品3份，稱取1．0 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取30，60，90 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0．45 μm微孔濾膜濾過，精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件注入高效液相色譜儀進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果加熱回流提取30 min人參皂苷Rg1含量為3．354 6 mg／g，加熱回流提取60 min人參皂苷Rg1含量為3．939 8 mg／g，加熱回流提取90 min人參皂苷Rg1含量為3．948 1 mg／g，說明用甲醇加熱回流提取60 min和90 min比加熱回流提取30 min含量高，但含量比較相近。故本品處理方法定為用甲醇加熱回流提取60 min。

靜置時(shí)間考察：取本品2份，稱取1．0g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量；一份靜置過夜；另一份未靜置；加熱回流提取60 min，放冷，再稱定質(zhì)量。用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0．45 μm微孔濾膜濾過，精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μL按上述色譜條件注入高效液相色譜儀進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果靜置過夜后人參皂苷Rg1含量為3．936 8 mg／g，未靜置的人參皂苷 Rg1含量為 3．940 4 mg／g，說明靜置過夜與未靜置的人參皂苷Rg1含量相近。故選擇未靜置過夜。

由于人參皂苷Rg1為紫外末端吸收，筆者設(shè)想測定人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1三者的總量，但試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，很難達(dá)到基線分離與準(zhǔn)確定量。筆者用過甲醇－水、甲醇－水－冰醋酸、乙腈－水、乙腈－水－冰醋酸等按不同比例進(jìn)行考察，結(jié)果以乙腈－0．05%磷酸水溶液（25∶75）為流動(dòng)相分離效果最好，出峰時(shí)間最短，且人參皂苷Rg1與雜質(zhì)峰和基線完全分離，達(dá)到含量測定的要求。

[1]WS－10988－（ZD －0998）－2002．國家藥品標(biāo)準(zhǔn)[S]．2002：13

[2]國家藥典委員會(huì)．中華人民共和國藥典（一部）[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：10．

[3]苗明三，李振國．現(xiàn)代實(shí)用中藥質(zhì)量控控制技術(shù)[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：36 －43．

[4]周自桂，郭 萍．HPLC法測定三七止血分散片中人參皂苷Rg1的含量[J]．江蘇藥學(xué)與臨床研究，2006，14（3）：190 －191．