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        十六烷基三甲基溴化銨強(qiáng)化產(chǎn)氫發(fā)酵

        2014-07-13 07:07:50任云利楊松波
        關(guān)鍵詞:產(chǎn)氫外膜通透性

        任云利,李 欣,張 柯,楊松波

        (河南科技大學(xué)化工與制藥學(xué)院,河南洛陽471023)

        0 引言

        化石燃料是當(dāng)今人類生產(chǎn)、生活的主要能源。隨著全球能量需求的增長,化石燃料等不可再生能源將日趨枯竭。氫能因具有可再生性和對(duì)環(huán)境友好的特性,成為最理想的能源載體之一。在各種產(chǎn)氫方法中,厭氧發(fā)酵制氫因其能耗低且可利用的底物廣泛,受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。通過優(yōu)化發(fā)酵條件(如發(fā)酵溫度、pH和底物濃度等)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)氫過程的強(qiáng)化已經(jīng)做了大量的研究[1]。近幾年,一些研究者嘗試在培養(yǎng)基中添加微生物生長代謝所需要的微量化學(xué)物質(zhì)(如金屬離子、煙酸、乳酸和L-半胱氨酸)實(shí)現(xiàn)強(qiáng)化發(fā)酵產(chǎn)氫[2-5]。

        各種類型微生物的產(chǎn)氫過程都是氫酶催化的可逆的氧化還原反應(yīng)。降低氫氣分壓,有利于可逆反應(yīng)向著產(chǎn)氫方向進(jìn)行。一些研究者通過降低發(fā)酵容器上空的氫氣分壓實(shí)現(xiàn)了累計(jì)產(chǎn)氫量的提高[6-7]。事實(shí)上,微生物細(xì)胞內(nèi)所產(chǎn)生的氫氣首先要經(jīng)過細(xì)胞膜釋放到培養(yǎng)基,然后再擴(kuò)散至反應(yīng)器的上空。而由細(xì)胞膜的流動(dòng)性所形成的孔徑(不超過0.5~1.0 nm)僅僅略大于氫氣分子的空氣動(dòng)力學(xué)直徑(0.3 nm)。因此,推測(cè)出提高微生物胞外膜的通透性,有可能從根本上降低胞內(nèi)的氫氣分壓,從而促進(jìn)產(chǎn)氫代謝。文獻(xiàn)[8]報(bào)道經(jīng)表面活性劑處理過的紅酵母細(xì)胞或者重組大腸桿菌細(xì)胞能顯著提高胞外膜的通透性,最終有效提高反式肉桂酸的轉(zhuǎn)化率。文獻(xiàn)[9]研究得出將十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)加入產(chǎn)氣腸桿菌(一種高效產(chǎn)氫菌)整細(xì)胞的懸浮液中,胞內(nèi)氫酶的活性可以得到檢測(cè)。因此,本文嘗試添加CTAB以提高產(chǎn)氫菌胞外膜的通透性,從而實(shí)現(xiàn)強(qiáng)化產(chǎn)氫的目的。

        木糖是自然界中大量存在的植物纖維水解后的重要單糖之一。以木糖為碳源,研究混合菌發(fā)酵過程中CTAB對(duì)菌體胞外膜通透性、對(duì)細(xì)菌生長和對(duì)累計(jì)產(chǎn)氫量、產(chǎn)氫速率的影響。這種通過添加微量的表面活性劑以強(qiáng)化產(chǎn)氫的方法為將來厭氧發(fā)酵制氫的研究拓展了思路。

        1 材料和方法

        1.1 菌種和培養(yǎng)基

        試驗(yàn)用的混合菌取自洛陽市生生乳業(yè)牛糞沼氣發(fā)酵池。接種之前,混合菌先在100℃條件下處理

        培養(yǎng)基組成:木糖10 g/L,蛋白凍5 g/L,磷酸二氫鉀14 g/L,磷酸氫二鉀6 g/L,硫酸銨2 g/L,檸檬酸鈉1 g/L,七水硫酸鎂0.2 g/L。

        1.2 試驗(yàn)方法

        胞外膜通透性試驗(yàn):將37℃條件下厭氧培養(yǎng)24 h后的新鮮菌液離心、收集菌體,然后用100 mmol的磷酸鹽緩沖液(pH=7)洗滌、離心、重懸后得到OD600(600 nm波長下光密度)為3.31的菌體懸浮液。取4 mL菌體懸浮液和0.2 mL、0~1.2 g/L的CTAB溶液一并裝入7 mL的血清瓶,在37℃ 放置15 min、90 min或135 min。然后在8 944g條件下離心2 min,測(cè)上清液在280 nm下的吸光度(A280)。比較不同條件下A280值,分析從胞內(nèi)釋放出蛋白的相對(duì)量,從而比較不同條件下胞外膜的通透性。

        批式發(fā)酵試驗(yàn):在500 mL的發(fā)酵瓶中裝入100 mL的培養(yǎng)基、5mL濃度為0~1.0 g/L CTAB水溶液,然后接入5 mL熱處理過的混合菌菌液,用橡膠塞密封。向發(fā)酵瓶中鼓吹N210 min,以確保發(fā)酵的厭氧環(huán)境。將發(fā)酵瓶置于水浴搖床,在37℃轉(zhuǎn)速為150 r/min的條件下發(fā)酵,所產(chǎn)生的氣體經(jīng)NaOH堿洗后用排水法收集[10]。

        1.3 分析方法

        氣相色譜檢測(cè)生物氣含量:Porapak Q不銹鋼填充柱,柱溫80℃,載氣為氮?dú)?,流速?0 mL/min,進(jìn)樣室溫度為80℃,檢測(cè)室熱導(dǎo)檢測(cè)器(TCD),檢測(cè)室溫度120℃,橋電流120 mA。

        1.4 產(chǎn)氫速率的計(jì)算

        批式發(fā)酵的產(chǎn)氫過程可由Logistic模型[11]

        進(jìn)行描述,其中,H為t時(shí)刻的累計(jì)產(chǎn)氫量,mL;P為產(chǎn)氫過程的產(chǎn)氫潛能,mL;λ為產(chǎn)氫過程的停滯時(shí)間,h;Rm為最大產(chǎn)氫速率,mL/h。

        2 結(jié)果和討論

        2.1 CTAB對(duì)胞外膜通透性的影響

        CTAB與細(xì)菌胞外膜的重要組成部分脂多糖的陽離子結(jié)合位點(diǎn)相互作用引起少量脂多糖的溶解,造成胞內(nèi)的一些蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)釋放到胞外。因此,CTAB可提高細(xì)胞膜的通透性。CTAB的濃度和對(duì)菌體的作用時(shí)間對(duì)上清液A280的影響見圖1。圖1底部的水平線表明不同濃度的 CTAB水溶液的A280相同,這意味著試驗(yàn)條件下CTAB濃度的高低對(duì)溶液的A280值沒有影響。因此,一定濃度的CTAB與菌體作用后所得上清液的A280的變化與CTAB的濃度無關(guān),而是單純由于胞內(nèi)的一些蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)釋放到胞外所引起的;不同CTAB濃度下所得上清液A280的大小表征了不同CTAB濃度下細(xì)胞膜的通透性的高低。

        由圖1可看出:當(dāng)CTAB的濃度小于0.004 8 g/L時(shí),A280未見明顯變化;當(dāng)CTAB的濃度大于0.009 5 g/L時(shí),A280隨著CTAB濃度的增加而顯著增加。這表明當(dāng)CTAB的濃度小于0.004 8 g/L時(shí),CTAB對(duì)菌體胞外膜的通透性幾乎沒有影響;而當(dāng)CTAB的濃度大于0.009 5 g/L時(shí),細(xì)胞膜的通透性隨著CTAB濃度的提高而提高。濃度為0.057 0 g/L的CTAB與作用15 min后得到A280的值達(dá)到2.05,是0.009 5 g/L時(shí)的3倍以上,此時(shí)細(xì)胞膜的通透性嚴(yán)重提高。此外,在相同的CTAB濃度下,CTAB和菌體作用時(shí)間由15 min延長至90 min或135 min,A280未見顯著提高,這暗示CTAB對(duì)菌體胞外膜通透性的改變?cè)?5 min內(nèi)已經(jīng)完成。

        圖1 CTAB的濃度和對(duì)菌體的作用時(shí)間對(duì)上清液A280的影響

        2.2 CTAB對(duì)菌體生長和產(chǎn)酸代謝的影響

        不同濃度的CTAB對(duì)發(fā)酵過程中的生物量的影響如圖2所示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明:在發(fā)酵進(jìn)行的最初9 h,CTAB的存在對(duì)生物量的增長有一定的抑制作用,且隨著CTAB濃度的增加抑制作用增強(qiáng)。這與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的高濃度的CTAB有一定的殺菌作用是一致的。發(fā)酵進(jìn)行9 h后,CTAB對(duì)生物量增長的抑制作用減弱。這可能是由于生物量的增長使得單位胞外膜所結(jié)合的CTAB的分子數(shù)下降所致。另一方面,當(dāng)菌外膜結(jié)合適當(dāng)數(shù)量的CTAB時(shí),細(xì)菌胞外膜通透性的提高有助于菌體與環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換,很可能促進(jìn)生物量的提高。發(fā)酵進(jìn)行12 h后,添加0.009 5 g/L和0.027 0 g/L CTAB的試驗(yàn)所得生物量達(dá)到并略超過空白試驗(yàn)的生物量水平。此外,當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行17 h后,4組試驗(yàn)的微生物的增長都進(jìn)入穩(wěn)定期,表明CTAB對(duì)微生物的生長周期無明顯影響。在0~0.045 0 g/L的CTAB的條件下,發(fā)酵終端穩(wěn)定的OD600值和pH值見圖3,圖3結(jié)果表明:該濃度下CTAB對(duì)產(chǎn)酸代謝和最終的生物量無明顯影響。

        圖2 不同濃度的CTAB對(duì)發(fā)酵過程中的生物量的影響

        圖3 培養(yǎng)基中不同濃度的CTAB對(duì)發(fā)酵終端的pH和OD600的影響

        2.3 CTAB對(duì)發(fā)酵產(chǎn)氫過程的影響

        厭氧發(fā)酵所產(chǎn)生的生物氣經(jīng)氣相色譜分析未檢測(cè)到CH4和H2S,僅含有H2和CO2兩種氣體。這意味著混合菌中的產(chǎn)甲烷菌和硫酸鹽還原菌,在初始pH為6.0缺乏有機(jī)酸的培養(yǎng)基中幾乎沒有生長繁殖。生物氣經(jīng)過堿洗裝置后所得氫氣的含量大于95%。

        發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的氫氣體積隨時(shí)間的變化曲線如圖4所示。由圖4可以看出:發(fā)酵的前8~10 h,CTAB對(duì)產(chǎn)氫過程有一定的抑制作用,且隨著CTAB濃度的增加抑制作用增強(qiáng);發(fā)酵進(jìn)行8~10 h后抑制作用減弱。且當(dāng)CTAB濃度小于0.027 0 g/L時(shí),產(chǎn)氫速率顯著提高。這與CTAB對(duì)混合菌生物量增長的影響規(guī)律一致(見圖2)。產(chǎn)氫發(fā)酵進(jìn)行28 h后,不同CTAB濃度條件下的產(chǎn)氫過程全部終止,這暗示CTAB對(duì)產(chǎn)氫代謝持續(xù)的時(shí)間沒有影響。值得一提的是,當(dāng)CTAB濃度在0~0.027 0 g/L的條件下,發(fā)酵所得累計(jì)產(chǎn)氫量隨著CTAB濃度的增加而增加。在0.027 0 g/L的CTAB環(huán)境下,獲得最大的累計(jì)產(chǎn)氫量為304 mL,此時(shí)產(chǎn)氫效率為13.6 mmol每克木糖,是對(duì)照試驗(yàn)(未添加CTAB)的1.38倍。

        圖4 不同濃度的CTAB條件下累計(jì)產(chǎn)氫體積隨發(fā)酵時(shí)間的變化

        用優(yōu)化的Logistic模型擬合產(chǎn)氫量隨時(shí)間的變化關(guān)系得到較高的相關(guān)性(R2≥0.99)。不同CTAB濃度條件下的擬合值,產(chǎn)氫潛力Pm、最大產(chǎn)氫速率Rm和停滯時(shí)間λ列于表1中。從表1中可以看出:當(dāng)培養(yǎng)基中添加0~0.027 0 g/L CTAB時(shí),累計(jì)產(chǎn)氫量、最大產(chǎn)氫速率以及產(chǎn)氫潛力隨著CTAB濃度的增加而增加。進(jìn)一步提高CTAB的濃度,累計(jì)產(chǎn)氫量、最大產(chǎn)氫速率以及產(chǎn)氫潛力均下降。在添加0.027 0 g/L CTAB的條件下得到最大產(chǎn)氫潛力327 mL和最大產(chǎn)氫速率19.57 mL/h,分別較對(duì)照試驗(yàn)提高了45%和44%。這說明通過改變胞外膜通透性能有效促進(jìn)產(chǎn)氫代謝,這可能與胞內(nèi)氫氣分壓的下降對(duì)產(chǎn)氫反應(yīng)的促進(jìn)作用和對(duì)吸氫反應(yīng)的抑制作用有關(guān)。然而進(jìn)一步提高培養(yǎng)基中CTAB的濃度,又表現(xiàn)出對(duì)產(chǎn)氫代謝的顯著抑制作用。0.045 0 g/L CTAB的條件下,所得累計(jì)產(chǎn)氫量和產(chǎn)氫速率分別為0.027 0 g/L CTAB的條件下的54%和60%,而在該濃度條件下CTAB對(duì)終端生物量和產(chǎn)酸代謝并無明顯抑制(見圖3)。文獻(xiàn)[13]報(bào)道產(chǎn)氣腸桿菌中產(chǎn)氫的關(guān)鍵性酶(氫酶)是膜結(jié)合酶。文獻(xiàn)[14]報(bào)道隨著CTAB濃度的增加,生物酶的活性下降。因此,過高濃度的CTAB對(duì)產(chǎn)氫過程的負(fù)面作用可能是由于氫酶的活性受到高濃度的CTAB的抑制引起的,這有待于進(jìn)一步研究。

        表1 不同濃度的CTAB 對(duì)發(fā)酵過程中的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

        另外,CTAB對(duì)產(chǎn)氫發(fā)酵的停滯時(shí)間也有顯著影響,且隨著CTAB濃度的增加停滯時(shí)間增加。在0.045 0 g/L的CTAB條件下,停滯時(shí)間由對(duì)照試驗(yàn)的2.33 h增加至7.29 h。CTAB對(duì)產(chǎn)氫發(fā)酵的停滯時(shí)間的影響與CTAB對(duì)生物量增長的影響有關(guān)(見圖2)。

        2.4 化學(xué)添加劑強(qiáng)化產(chǎn)氫發(fā)酵的文獻(xiàn)對(duì)比

        本文研究得出CTAB是用于暗發(fā)酵產(chǎn)氫的一種有效的化學(xué)添加劑。文獻(xiàn)報(bào)道的化學(xué)添加劑對(duì)光發(fā)酵和暗發(fā)酵產(chǎn)氫的影響總結(jié)如表2所示。由表2可以看出:煙酸和MoO2-4對(duì)光發(fā)酵產(chǎn)氫過程的強(qiáng)化作用顯著,在適宜濃度的煙酸或者M(jìn)oO2-4的環(huán)境下,產(chǎn)氫速率的強(qiáng)化倍數(shù)可達(dá)到3以上。各種添加劑對(duì)暗發(fā)酵過程中產(chǎn)氫速率和累計(jì)產(chǎn)氫量的強(qiáng)化倍數(shù)一般都小于2。本研究中CTAB與其他用于暗發(fā)酵的添加劑相比,累計(jì)產(chǎn)氫量和產(chǎn)氫速率的強(qiáng)化倍數(shù)相當(dāng),但CTAB的用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于其他添加劑。

        各種添加劑對(duì)產(chǎn)氫過程的作用機(jī)理不同。Ni2+,F(xiàn)e2+和MoO2-4是氫酶或者鉬固氮酶的組成成分,所以添加Ni2+,F(xiàn)e2+和MoO24促進(jìn)了產(chǎn)氫的原因可能與氫酶或者鉬固氮酶活性的提高有關(guān)。添加乳酸對(duì)產(chǎn)氫過程的強(qiáng)化可能是由于甲酸和乙醇的代謝途徑向丁酸代謝途徑轉(zhuǎn)換所致[3]。有關(guān)L-胱氨酸的強(qiáng)化機(jī)理目前尚不清楚。本研究中CTAB對(duì)產(chǎn)氫發(fā)酵的強(qiáng)化作用可能是由于CTAB與胞外膜結(jié)合引起胞外膜溶解而使胞外膜的通透性提高。

        表2 通過化學(xué)添加劑強(qiáng)化產(chǎn)氫發(fā)酵的文獻(xiàn)對(duì)比

        3 結(jié)論

        本研究通過在培養(yǎng)基中添加微量的CTAB,實(shí)現(xiàn)了強(qiáng)化發(fā)酵產(chǎn)氫的目的。CTAB對(duì)混合菌胞外膜通透性,對(duì)發(fā)酵過程中產(chǎn)氫速率、累計(jì)產(chǎn)氫量、生物量增長和產(chǎn)氫停滯時(shí)間都有一定程度的影響。

        (1)濃度大于0.009 5 g/L的CTAB溶液可有效提高混合菌菌體胞外膜的通透性。

        (2)在發(fā)酵過程中的前9 h內(nèi),CTAB對(duì)混合菌的生長繁殖有一定的抑制作用,但濃度小于0.045 0 g/L的CTAB對(duì)發(fā)酵終端的生物量沒有明顯影響;CTAB的存在使得產(chǎn)氫發(fā)酵過程中的停滯時(shí)間延長,且隨著CTAB濃度的增加而增加。

        (3)0.095 0~0.027 0 g/L的CTAB可有效地強(qiáng)化混合菌的產(chǎn)氫發(fā)酵過程。并在CTAB濃度為0.027 0 g/L時(shí)得到最大產(chǎn)氫效率(13.6 mmol每克木糖)和最大的產(chǎn)氫速率(19.6 mL/h),與對(duì)照試驗(yàn)相比分別提高38%和44%。

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