張 艷， 任 榮， 張 蕾

(新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院腎病科, 烏魯木齊 830011)

最新流行病學調查報告顯示，我國20歲以上人群糖尿病患病率已達9.7%，而糖尿病前期的患病率高達15.5%，估計目前我國約有92 00萬人糖尿病患者、148 00萬人糖尿病前期患者。糖尿病已成為威脅我國公眾健康的重大疾病[1]。糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease，DKD)的患病率也逐年增加。據報道，亞洲人群中2型糖尿病患者并發(fā)微量白蛋白尿的比例高達55%[2]。在美國糖尿病導致的終末期腎臟疾病(ESRD)患者占透析總人數(shù)的54%[3]。研究發(fā)現(xiàn)，相對于腎小球病變，腎小管病變與腎功能惡化有更密切相關關系[4]，腎小管間質改變并非繼發(fā)于腎小球病變，而是DKD早期病變和原始特征之一[5-8]。糖尿病腎病起病隱匿，早期缺乏明顯的臨床表現(xiàn)，一旦進展至臨床糖尿病腎病期，腎功能常進行性惡化。目前就糖尿病腎病(DN)的診斷而言，傳統(tǒng)的腎活檢由于具有一定的創(chuàng)傷性，限制了其臨床應用，而尿白蛋白的檢測又存在特異性不高的缺陷[9]。因此，醫(yī)學界對DN生物標志物進行了大量的研究，不僅有助于更好地闡明DN的發(fā)生機制，且對DN的早期診斷、治療效果的檢測及預后的判斷均具有重大意義。近期研究發(fā)現(xiàn)泛素核糖體結合蛋白52(UBA52)在早期糖尿病腎病患者中有其特異性。本研究以新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院101例住院患者為研究對象，檢測比較健康對照者、糖尿病及糖尿病腎病者血與尿UBA52、N-乙酰-β-D氨基葡萄糖甘酶(NAG酶)、α1微球蛋白、血糖、糖化血紅蛋白及腎小球濾過率(glomerular filtration rate，GFR)指標的差異，并探討其與尿UBA52的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院住院患者101例，隨機分為3組：正常對照組22例，糖尿病組(DM組)20例，糖尿病腎病組(DN組)59例。納入標準：(1)年齡≥18歲，血肌酐<265 μmol/L，自愿加入本研究的健康人群及患者；(2)糖尿病組所有患者必須符合2010《中國2型糖尿病防治指南》糖尿病診斷標準。排除標準：(1)有發(fā)熱、腫瘤、妊娠、充血性心衰之一者；(2)糖尿病腎病組排除內生肌酐清除率≥265 μmol/L者；(3)正常對照組排除糖尿病、高血壓、腎臟疾病患者；(4)糖尿病腎病組排除其他原因導致的腎臟損害如高血壓腎損害、原發(fā)性腎炎、腎病綜合征、IgA腎病等患者。金標準:同時符合下列條件者為陽性，否則為陰性：(1)符合2010年《中國2型糖尿病防治指南》糖尿病診斷標準；(2)白蛋白/肌酐(albumin-to-creatinine ratio，ACR)≥30 μg/mg。3組年齡、性別分布及體質指數(shù)(BMI)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

1.2方法

1.2.1 血標本采集 血標本采集前3 d無肌酐飲食，并限蛋白入量，避免劇烈運動，使血中內生肌酐濃度達到穩(wěn)定；第4天清晨采血標本3 mL，分別裝入免疫管和生化管。

表1 一般特征表

1.2.2 尿標本采集 (1)ACR尿標本為空腹8 h晨起第1次清潔中段尿5 mL。(2)使用校正的簡化“腎臟病膳食改良試驗(MDRD)”公式計算GFR。尿標本采集方法：為排除來自動物骨骼肌和大量蛋白質食物中外源性肌酐的干擾，試驗前3 d給受試者無肌酐飲食，并限蛋白入量，避免劇烈運動，使血中內生肌酐濃度達到穩(wěn)定。試驗前24 h禁服利尿劑，留取24 h尿，其間保持適當?shù)乃秩肓?，禁服咖啡、茶等利尿性物質，準確計量全部尿量(mL)。

1.2.3 尿微量白蛋白及UBA52的檢測 采用免疫透射比濁法檢測尿微量白蛋白,早晨抽取空腹靜脈血3 mL分離血清。檢測儀器為BECKMAN 8000，由同一經驗豐富的檢驗醫(yī)師檢驗。采用酶聯(lián)免疫法檢測UBA52，UBA52 ELISA KIT從 “抗體在線”購買；由3名培訓合格的實驗研究人員進行檢驗操作。

2 結果

2.13組相關指標的比較DN組NAG酶、α1微球蛋白、GFR、血糖、糖化血紅蛋白、血及尿UBA52水平均高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；DM組NAG酶、α1微球蛋白、血糖及糖化血紅蛋白與正常對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；DM和DN組比較，GFR在DN組中升高更為明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，血、尿UBA52水平在DM和DN組中均有升高，且尿UBA52在DN組中升高更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 3組相關指標的比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05； 與DM組比較，●P<0.05。

2.2尿UBA52的影響因素分析以尿UBA52為因變量，分別以血UBA52、NAG酶、α1微球蛋白、GFR、血糖、糖化血紅蛋白為自變量行逐步多元線性回歸?；貧w方程式：尿UBA52(ng/mL)=-0.697+0.001 ACR+血UBA52(ng/mL)+0.028 NAG酶+0.003 GFR-0.71糖化血紅蛋白-1.99尿UBA52(ng/mL)；方程檢驗：F=21.392，P=0.000，回歸方程決定系數(shù)為0.678，標準決定系數(shù)為0.646，P=0.014。比較標準偏回歸系數(shù)，結果顯示血UBA52、NAG酶、糖化血紅蛋白及腎小球濾過率對尿UBA52的升高均有影響，見表3。

表3 逐步回歸參數(shù)方程的參數(shù)估計

3 討論

糖尿病腎病是引起終末期腎臟疾病(ESRD)最常見的原因，約占ESRD患者的40%～50%[6,10]。近年來隨著蛋白質組學技術在生物醫(yī)學領域的廣泛應用，研究者已經開始利用蛋白質組學技術篩選能更早、更準確地預測或診斷DN病情進展與監(jiān)測預后的生物標志物,其中泛素核糖體結合蛋白52(UBA52)是一種泛素核糖體結合蛋白。Dihazi等[11]研究糖尿病腎病及糖尿病合并其他腎病患者尿液蛋白質譜發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者尿液特異性表達質核比為14 766的蛋白質，并提出該蛋白可作為糖尿病腎病診斷性尿蛋白，后證實該蛋白為泛素-核糖體融合蛋白52(UBA52)，是游離泛素分子的前體[12]。糖尿病腎病可以通過高糖和各種應激反應激活相應增強子，加強轉錄，表達UBA52[13-14]。在泛素水解酶的作用下可水解釋放大量游離泛素分子維系泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-ptoteasome path，UPP)的活性[15]。

早在1999年，首次克隆出了鼠UBA52基因(GenBank AF118402)[16]，并通過削減雜交方法發(fā)現(xiàn)DN腎組織中UBA52表達增高；2002年用原位雜交技術和免疫組化技術進一步確定UBA52表達在腎小管，且證實與DN進展密切相關[14]。近年來許多研究證明腎小管損傷在DKD發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。DKD腎小管損傷的主要病理表現(xiàn)是小管細胞增生、肥大、萎縮、凋亡、轉分化等改變，同時小管周圍有炎性細胞浸潤及不同程度小管間質纖維化，國內外新近的大量研究提示，UPP參與了糖尿病腎病腎臟纖維化多條信號通路中重要的蛋白分子，引起信號通路的過度持久活化，對腎小球系膜細胞凋亡、抗原提呈、炎癥演進和基因轉錄等多方面進行上調或下調，并促進腎臟纖維化，在糖尿病腎病的進展中起到重要作用。本研究的檢測結果也證實了血、尿UBA52在早期糖尿病腎病診斷中的優(yōu)勢所在，糖尿病組和糖尿病腎病組NAG酶、α1微球蛋白較正常對照組升高，但糖尿病組與糖尿病腎臟病組無明顯差異，說明無論在糖尿病或糖尿病腎病組中，早期均有腎小管的受損，且以上指標尚受炎癥、創(chuàng)傷的影響，雖敏感，但不特異。而檢測的血、尿UBA52。僅在糖尿病腎病組中有顯著升高，而糖尿病組和正常對照組血、尿UBA52無明顯差異。本研究還發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病組尿UBA52較糖尿病組和正常對照組上升更加明顯，提示尿UBA52可能是DN早期尿蛋白出現(xiàn)之前判斷腎損害的有效生物標志，及時檢測尿UBA52水平，可協(xié)助判定DN小管細胞損傷，且該項檢查無創(chuàng)、簡便。為進一步了解尿UBA52受何因素影響，本研究進一步以尿UBA52為因變量，其余指標為自變量行逐步多元線性回歸，比較標準偏回歸系數(shù)發(fā)現(xiàn)血UBA52、NAG酶、糖化血紅蛋白及腎小球濾過率對尿UBA52的升高有影響。

綜上所述，UBA52檢測不僅可以反映早期腎臟損害及程度，同時有助于判斷損害部位，且受NAG酶、糖化血紅蛋白及腎小球濾過率的影響。因其在糖尿病腎病患者中特異性表達，可以提高診斷早期糖尿病腎病的特異度，重視并深入研究DKD小管細胞損傷的機制對防治DKD進展意義深遠。

參考文獻:

[1] Yang WY, Lu JM, Weng JP, et al. Prevalence of diabetes among men and women in China[J]. N Engl J Med, 2010, 362(12):1090-1101.

[2] Parving HH, Lewis JB, Ravid M, et al. Prevalence and risk factors for microalbuminuria in a referred cohort of type II diabetic patients:a global perspective[J]. Kidney Int, 2006, 69(11):2057-2063.

[3] Weiner DE. Watnick SG. The 2009 pmpesed rule for prospective ESRD payment:historical perspectives andpublic polices-bundle Up[J].Am J Kidney Dis, 2010, 55:217-222.

[4] Phillips AO, Steadman R. Diabetic nephropathy:the central role of renal proximal tubular cells in tubulointerstitial injury[J]. Histol Histopathol, 2002, 17(1):247-252.

[5] Tang SC, Leung JC, Lai KN. Diabetic tubulopathy:an emerging entity[J]. Contrib Nephrol, 2011, 170(170):124-134.

[6] Kanwar YS, Sun L, Xie P, et al. A glimpse of various pathogenetic mechanisms of diabetic nephropathy[J]. Annu Rev Pathol, 2011, 6(6):395-423.

[7] Najafian B, Kim Y, Crosson JT, et al. Atubular glomeruli and glomerulotubular junction abnormalities in diabetic nephropathy[J]. J Am Soc Nephrol, 2003, 14(4):908-917.

[8] Dalla VM, Saller A, Bortoloso E, et al. Structural involvement in type 1 and type 2 diabetic nephropathy[J].Diabetes Metab，2000,26:8-14.

[9] Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Enhancing the predictive value of urinary albumin for diabetic nephropathy[J]. J Am Soc Nephrol, 2006, 17(2):339-352.

[10] Lin S, Sabai A, Chugh SS, et al. High glucose stimulates synthesis of fibronectin via flnovel protein kinase C,Raplb,and B-Raf signaling pathway[J].J Biol Chem，2002,277:41725-41735.

[11] Dihazi H, Müller GA, Lindner S, et al. Characterization of diabetic nephropathy by urinary proteomic analysis:identification of a processed ubiquitin form as a differentially excreted protein in diabetic nephropathy patients[J]. Clin Chem, 2007, 53(9):1636-1645.

[12] Usami S, Takumi Y, Suzuki N, et al. The localization of proteins encoded by CRYM, KIAA1199, UBA52, COL9A3, and COL9A1, genes highly expressed in the cochlea[J]. Neuroscience, 2008, 154(1):22-28.

[13] Sun L, Pan X, Wada J, et al. Isolation and functional analysis of mouse UbA52 gene and its relevance to diabetic nephropathy[J]. J Biol Chem, 2002, 277(33):29953-29962.

[14] Wada J, Sun L, Kanwar YS. Discovery of genes related to diabetic nephropathy in various animal models by current techniques[J]. Contrib Nephrol, 2011, 169:161-174.

[15] Yin ST, Huang H, Zhang YH, et al. A fluorescence assay for elucidating the substrate specificities of deubiquitinating enzymes[J]. Biochem Biophys Res Commun，2011，416(1-2)：76-79.

[16] Sun L, Wüthrich RP. Molecular identification of a murine ubiquitin/60S ribosomal fusion protein and expression study in mouse kidney[J]. Biochem Genet, 1999, 37(3/4):139-147.