徐萬龍， 徐江波， 孫俊剛， 周文正， 趙喜濱， 王 浩， 袁 宏

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨一科， 烏魯木齊 830001)

棘球蚴病又稱包蟲病，是由棘球絳蟲的幼蟲寄生在人畜之間相互傳染的寄生蟲病，嚴重危害全球人類的健康[1]。當棘球絳蟲的幼蟲寄生于骨組織，即可發(fā)生骨棘球蚴病。針對骨包蟲病，現(xiàn)有的藥物、手術等治療手段療效差，復發(fā)率及致殘率高。近些年，三維適形調強放療(Intensity modulated radiation therapy,IMRT)因其良好的腫瘤殺滅率、周圍器官保護性等臨床優(yōu)勢，已成為臨床腫瘤治療最重要的手段之一。根據(jù)IMRT對腫瘤細胞有很好的殺滅效果及對周圍器官良好的安全保護作用，部分學者認為IMRT對骨棘球蚴細胞也應該有很好的殺滅作用，而且對周圍組織很好的生物安全性[2-4]。本研究通過模擬臨床對棘球蚴病區(qū)實施IMRT，觀察IMRT對鼠繼發(fā)性骨棘球蚴的殺滅效果及周圍神經(jīng)的損傷，以期探討IMRT對骨棘球蚴病的治療有效性及安全性。

1 材料與方法

1.1實驗動物的選取及放射治療選用中國武警總醫(yī)院實驗動物實驗室提供的雙側股骨繼發(fā)性棘球蚴病成年雄性大鼠50只。將骨包蟲大鼠先行X線及CT檢查，均提示股骨繼發(fā)性棘球蚴接種成功。骨棘球蚴病大鼠吸入麻醉后，俯臥位擺置于自制的放療體膜內并穩(wěn)定固定。采用飛利浦Mx8000多層螺旋CT掃描機對左側股骨棘球蚴病區(qū)進行掃描，掃描密度為1 mm/層，將收集的數(shù)據(jù)上傳到Somavison系統(tǒng)內，進行信息重建，并將周圍的血管、肌腱、神經(jīng)、皮膚勾畫為需要保護的器官。勾畫完放療區(qū)域后，利用三維適形調強放療儀的計算機計算系統(tǒng)對骨包蟲區(qū)域的放射劑量及劑量分布均勻程度按照放療計劃進行分析和計算。經(jīng)專業(yè)放射物理師對50只鼠股骨棘球蚴病區(qū)給予40 Gy劑量的IMRT治療。

1.2取材將經(jīng)IMRT放射治療后的棘球蚴病鼠吸入麻醉處理后，空氣栓塞活殺處死，在顯微鏡下取出股骨骨髓腔內的棘球蚴的包囊，經(jīng)甲醛、戊二醛浸泡保存以及液氮低溫保存。

1.3Westernblot法定量檢測骨棘球蚴包囊中凋亡相關蛋白Caspase-3的表達使用RIPA裂解細胞抽提總蛋白, BCA法蛋白定量。將樣本轉膜到PVDF膜上，脫脂牛奶后進行封閉, 添加一抗(β-actin, 1∶2 000；Caspase-3, 1∶200) ，室溫過夜。沖洗后加入二抗，室溫保存沖洗后, ECL顯影。采用Western blot法定量檢測骨棘球蚴包囊中凋亡相關蛋白Caspase-3的表達。

1.4光鏡、電鏡檢測坐骨神經(jīng)神經(jīng)元細胞形態(tài)將經(jīng)甲醛固定的標本，石蠟包埋后行4 μm切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察坐骨神經(jīng)神經(jīng)元的組織學改變。將經(jīng)戊二醛、鋨酸處理后的坐骨神經(jīng)組織再次進行浸泡，用緩沖液進行反復沖洗，然后采用階梯濃度的醫(yī)學酒精進行反復脫水處理，再次用緩沖液進行反復沖洗后將其浸泡于丙酮中低溫保存。采用環(huán)氧樹脂、固化劑等進行浸泡后包埋并烘干，將組織塊進行休整并切片后鋪于金屬銅網(wǎng)表面。依次進行枸櫞酸鉛、醋酸鈾染色。在光鏡、電鏡下觀察接受放療后坐骨神經(jīng)神經(jīng)元細胞的形態(tài)學。

2 結果

2.1Westernblot法定量檢測骨棘球蚴包囊中凋亡相關蛋白Caspase-3表達的結果Western blot法檢測到大鼠股骨棘球蚴包囊的細胞中凋亡相關蛋白Caspase-3大量表達，見圖 1。

圖1 Western blott檢測Caspase-3蛋白表達圖

2.2光鏡、電鏡檢測坐骨神經(jīng)神經(jīng)元細胞形態(tài)結果HE染色顯示接受IMRT放療后骨棘球蚴鼠的坐骨神經(jīng)神經(jīng)元細胞形態(tài)基本正常，少量神經(jīng)元細胞為可逆性變化，神經(jīng)元細胞形態(tài)為三角形或多邊形，樹突軸突清晰可見，細胞核形態(tài)飽滿，結構均正常，尼氏小體數(shù)量豐富，于胞漿內分布均勻(圖2)。透射電鏡檢測結果顯示，接受IMRT放療后骨棘球蚴鼠的坐骨神經(jīng)神經(jīng)元細胞正常形態(tài)，細胞膜未出現(xiàn)破裂，胞質內細胞器形態(tài)完整，細胞核居中，無固縮(圖3)。

圖2 IMRT放療后骨棘球蚴鼠的坐骨神經(jīng)神經(jīng)元(HE×400)

3 討論

放射治療是治療惡性腫瘤最重要的手段之一，21世紀以來，隨著影像學技術、計算機技術的快速進展，放射治療已進入了精確放療的時代，其中三維適形調強放療(Intensity modulated radiation therapy,IMRT)已成為最具代表性的放療技術。IMRT是通過計算機控制射線的方向，將精確的、劑量高的射線集中在醫(yī)者所關心的病變組織區(qū)域，而周圍組織很少受到射線的損傷，所以IMRT是現(xiàn)有臨床上一種可靠的、精度高的放射治療方法，受到學者的推崇[2-4]。

圖3 IMRT放療后骨棘球蚴鼠的坐骨神經(jīng)神經(jīng)元(電鏡 8 000倍)

本研究結果提示IMRT作用1 w后，Western blot法檢測到鼠股骨棘球蚴包囊的細胞中凋亡相關基因Caspase-3大量表達，說明在IMRT的作用下鼠股骨棘球蚴包囊的細胞產(chǎn)生了不可逆性的凋亡，說明IMRT對大鼠繼發(fā)性骨棘球蚴病有很好的殺滅作用及其有效性。坐骨神經(jīng)是下肢放療最重要的、需要保護的器官，而光鏡、電鏡檢測結果提示鼠股骨棘球蚴包囊周圍的坐骨神經(jīng)神經(jīng)元細胞形態(tài)結構正常，未受到放射線損傷，提示IMRT在治療骨棘球蚴病方面具有很高的周圍組織安全性。

本研究結果提示IMRT對鼠繼發(fā)性骨棘球蚴病有很好的治療效果，而且有很高的安全性?？紤]其原因：IMRT通過對鼠繼發(fā)性骨棘球蚴病靶區(qū)的精確定位、精確計劃、精確照射可以使靶區(qū)接受最大的治療放射線，而周圍組織承受的劑量大大降低，從而減少了周圍重要器官發(fā)生放射損傷的幾率。所以本實驗中并未發(fā)生普通放療治療骨棘球蚴病而出現(xiàn)的病鼠照射部位出現(xiàn)脫毛及皮膚潰瘍[5]。本研究認為臨床上將IMRT用于骨包蟲的治療，具有以下優(yōu)點: (1)體外照射，不手術，無侵入性，創(chuàng)傷??；(2)不會造成囊液和囊內容物的泄漏，減少異位種植，減少因骨包蟲囊壁破裂、溢漏引起的過敏性休克甚至死亡；(3)放射線可徹底清除深藏于松質骨、骨小梁中間的骨包蟲頭節(jié)，降低骨包蟲殘留率、復發(fā)率；(4)IMRT射線集中，局部高能殺滅骨包蟲，周圍組織損傷低，且減少長期服藥對肝、腎的損傷；(5)住院期間即可完成治療，避免患者出院后長期服藥，增加患者依從性。

本實驗初步證實IMRT對鼠繼發(fā)性骨棘球蚴病有很好的治療效果，而且有很高的安全性，但本研究只是初步的動物實驗研究，要將此結果推廣、應用于臨床，還需要通過大宗的臨床研究進行驗證。

參考文獻:

[1] Wang K, Zhang X, Jin Z, et al. Modeling and analysis of the transmission of Echinococcosis with application to Xinjiang Uygur Autonomous Region of China[J]. J Theor Biol, 2013, 333(10): 78-90.

[2] 徐萬龍，瓦熱斯江·尼牙孜，塔依爾江·舉來提，等. 三維適形調強放療聯(lián)合口服阿苯噠唑對新疆大鼠繼發(fā)性骨棘球蚴病的治療作用[J]. 醫(yī)學動物防制, 2012, 28(11): 1181-1183.

[3] 徐萬龍，繆曉剛，塔依爾江·舉來提，等. 三維適形調強放療對新疆大鼠繼發(fā)性骨棘球蚴病的影響[J]. 中國實用醫(yī)刊, 2012, 39(18): 41-43.

[4] Xu WL, Xilinbaoleri, Liu H, et al. Spinal cord biological safety of image-guided radiation therapy versus conventional radiation therapy[J]. Neural Regenerat Res, 2012, 7(35): 2755-2760.

[5] 謝增如，李振環(huán). 骨細粒棘球蚴病動物模型的放療效果[J]. 中國實驗外科雜志, 2009, 26(12): 1768.