徐萬(wàn)龍， 徐江波， 孫俊剛， 周文正， 趙喜濱， 王 浩， 袁 宏

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨一科， 烏魯木齊 830001)

我國(guó)細(xì)粒棘球蚴病的發(fā)病率很高[1]，尤其是地處邊疆的新疆[2]。細(xì)粒棘球蚴病是在人畜之間相互傳染的寄生蟲(chóng)病，嚴(yán)重危害全球人類(lèi)的健康。骨細(xì)粒棘球蚴病在人體各臟器包蟲(chóng)病的發(fā)病率位居第3位，肝臟和肺臟的包蟲(chóng)病發(fā)病率則位居第1、2位。目前臨床上現(xiàn)有的藥物以及手術(shù)的治療方式對(duì)細(xì)粒棘球蚴病幾乎不能根治，臨床療效較差，而放射治療對(duì)骨包蟲(chóng)具有很好的殺滅作用。細(xì)粒棘球蚴的原頭節(jié)是其包囊中活力最強(qiáng)、感染力最大的結(jié)構(gòu)，如果細(xì)粒棘球蚴的原頭節(jié)在宿主體內(nèi)繁殖生長(zhǎng)，則可以很快播散并成長(zhǎng)為新的傳播性很強(qiáng)的棘球蚴，所以如何殺滅原頭節(jié)是殺滅細(xì)粒棘球蚴的重要環(huán)節(jié)及重要靶點(diǎn)。

為觀(guān)察放射治療對(duì)大鼠骨細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)有很好的殺滅效果，本研究通過(guò)對(duì)骨細(xì)粒棘球蚴病大鼠骨棘球蚴病灶區(qū)實(shí)施IMRT，檢測(cè)原頭節(jié)死亡率、原頭節(jié)琥珀酸脫氫酶(SDH)的活性變化，以期為臨床上將IMRT用于對(duì)骨細(xì)粒棘球蚴病的治療提供直接實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用中國(guó)武警總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供的雙側(cè)股骨骨細(xì)粒棘球蚴成年雄性大鼠30只。將骨包蟲(chóng)大鼠雙側(cè)股骨先行X線(xiàn)及CT檢查，均提示雙側(cè)股骨繼發(fā)性棘球蚴接種成功。骨細(xì)粒棘球蚴大鼠吸入麻醉后，俯臥位擺置于自制的放療體膜內(nèi)并穩(wěn)定固定。采用飛利浦Mx8000多層螺旋CT掃描機(jī)對(duì)左側(cè)股骨骨細(xì)粒棘球蚴病區(qū)進(jìn)行掃描，掃描密度為1 mm/層，將收集的數(shù)據(jù)上傳到Somavison系統(tǒng)內(nèi)，進(jìn)行信息重建，并將周?chē)难堋⒓‰?、神?jīng)、皮膚勾畫(huà)為需要保護(hù)的器官。勾畫(huà)完放療區(qū)域后，利用三維適形調(diào)強(qiáng)放療儀的計(jì)算機(jī)計(jì)算系統(tǒng)對(duì)股骨細(xì)粒棘球蚴病區(qū)域的放射劑量及劑量分布均勻程度按照放療計(jì)劃進(jìn)行分析和計(jì)算。經(jīng)專(zhuān)業(yè)放射物理師在14 d內(nèi)，對(duì)30只大鼠左側(cè)股骨骨細(xì)粒棘球蚴病區(qū)給予40 Gy劑量的IMRT治療，右側(cè)股骨只給予假照射作為陰性對(duì)照。

1.2取材將經(jīng)IMRT放射治療后的棘球蚴病大鼠吸入麻醉處理后，空氣栓塞活殺處死，在顯微鏡下取出雙側(cè)股骨骨髓腔內(nèi)的骨細(xì)粒棘球蚴的包囊，先將細(xì)粒棘球蚴的包囊部分囊液抽出進(jìn)行囊內(nèi)減壓，其余的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)連同囊液全部吸出，并將其混勻成的懸液分裝于無(wú)菌聚乙烯試管中。

1.3伊紅染色將無(wú)菌聚乙烯試管中細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的懸濁液用臺(tái)盼藍(lán)染色約2 min后涂片，在倒置顯微鏡下觀(guān)察計(jì)算原頭節(jié)的死亡率。判斷死亡率的原則：死亡的原頭節(jié)結(jié)構(gòu)破壞，而且臺(tái)盼藍(lán)染色著色；活頭節(jié)結(jié)構(gòu)良好，且臺(tái)盼藍(lán)染色不著色。壞死率=臺(tái)盼藍(lán)染色著色原頭節(jié)數(shù)/所有原頭節(jié)數(shù)×100%。

1.4酶化學(xué)染色法檢測(cè)原頭節(jié)琥珀酸脫氫酶(SDH)的活性將無(wú)菌聚乙烯試管中細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的懸濁液用臺(tái)盼藍(lán)染色約2 min后涂片，采用烘干裝置將所涂涂片烘干，采用硝基藍(lán)四唑法將圖片進(jìn)行染色后顯微鏡下觀(guān)察。琥珀酸脫氫酶活性陽(yáng)性的細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色。應(yīng)用BT-2000彩色病理圖像分析系統(tǒng)，每張圖片隨機(jī)選10個(gè)視野，自動(dòng)測(cè)量平均光密度(Mean Optical Density，MOD)值，并取其平均值代表該原頭節(jié)琥珀酸脫氫酶(SDH)的活性。

2 結(jié)果

2.1伊紅染色檢測(cè)IMRT后骨細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)死亡情況未接受放療的右側(cè)股骨骨細(xì)粒棘球蚴病區(qū)的骨棘球蚴原頭節(jié)正常形態(tài)存在，輪廓清晰，原頭節(jié)可排斥臺(tái)盼藍(lán)染色，原頭節(jié)未被藍(lán)染(圖1)。接受IMRT放療后左側(cè)股骨骨細(xì)粒棘球蚴病區(qū)的骨棘球蚴原頭節(jié)整體結(jié)構(gòu)消失，輪廓失去飽滿(mǎn)狀態(tài)，出現(xiàn)塌陷，原頭節(jié)內(nèi)顏色渾濁，出現(xiàn)深藍(lán)色沉著(圖2)。未接受放療的右側(cè)股骨骨細(xì)粒棘球蚴病區(qū)的骨棘球蚴原頭節(jié)死亡率為(3.55±1.97)%，遠(yuǎn)小于接受IMRT放療后左側(cè)股骨骨細(xì)粒棘球蚴病區(qū)的骨棘球蚴原頭節(jié)死亡率(51.22±19.34)%，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2酶化學(xué)染色法檢測(cè)原頭節(jié)琥珀酸脫氫酶(SDH)的活性結(jié)果未接受IMRT治療的右側(cè)股骨骨細(xì)粒棘球蚴病區(qū)的骨棘球蚴原頭節(jié)琥珀酸脫氫酶大量表達(dá)(圖3)，但I(xiàn)MRT作用后的左側(cè)股骨骨細(xì)粒棘球蚴病區(qū)的骨棘球蚴原頭節(jié)琥珀酸脫氫酶受到抑制，少量表達(dá)(圖4)。未接受放療的左側(cè)股骨骨細(xì)粒棘球蚴病區(qū)的骨棘球蚴原頭節(jié)琥珀酸脫氫酶SDH產(chǎn)物的平均光密度數(shù)值為(0.719 3±0.114 5)，遠(yuǎn)大于接受IMRT放療后右側(cè)股骨骨細(xì)粒棘球蚴病區(qū)的骨棘球蚴原頭節(jié)平均光密度數(shù)值(0.101 5±0.032 0)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 未受放療的骨細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)(伊紅染色×10)

圖2 IMRT放療后的骨細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)(伊紅染色×10)

圖3 未受放療的骨細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)(酶化學(xué)染色法×40)

圖4 IMRT放療后的骨細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)(酶化學(xué)染色法×40)

3 討論

三維適形調(diào)強(qiáng)放療(Intensity modulated radiationtherapy，IMRT)是通過(guò)計(jì)算機(jī)來(lái)控制射線(xiàn)的方向，可將精確的、劑量高的射線(xiàn)集中在醫(yī)者所關(guān)心的病變組織區(qū)域，而周?chē)M織很少受到射線(xiàn)的損傷，所以IMRT是現(xiàn)有臨床上一種可靠的、精度高的放射治療方法，受到學(xué)者的推崇。根據(jù)IMRT對(duì)腫瘤細(xì)胞有很高的殺滅作用，所以筆者認(rèn)為IMRT對(duì)骨細(xì)粒棘球蚴的原頭節(jié)也應(yīng)該有很好的殺滅作用。故本研究通過(guò)對(duì)骨細(xì)粒棘球蚴的原頭節(jié)實(shí)施IMRT，對(duì)原頭節(jié)行伊紅染色檢測(cè)原頭節(jié)死亡率；酶化學(xué)染色法檢測(cè)原頭節(jié)琥珀酸脫氫酶(SDH)的活性變化，可以觀(guān)察到IMRT射線(xiàn)集中、局部高能骨細(xì)粒棘球蚴的原頭節(jié)，而且放射線(xiàn)可徹底清除深藏于松質(zhì)骨、骨小梁中間的骨細(xì)粒棘球蚴的原頭節(jié)，降低骨包蟲(chóng)殘留率、復(fù)發(fā)率。

細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)棘球蚴囊壁的生發(fā)層(胚層)可向囊內(nèi)長(zhǎng)出許多原頭節(jié)(protoscolex)和生發(fā)囊。原頭節(jié)的頭節(jié)向內(nèi)翻卷收縮呈橢圓形或圓形。生發(fā)囊是具有一層生發(fā)層的小囊，可附于囊壁生發(fā)層或脫落懸浮在囊液中，生發(fā)囊內(nèi)又可有許多頭節(jié)或更小的囊，因此1個(gè)棘球蚴囊內(nèi)原頭節(jié)數(shù)量可有數(shù)千至數(shù)萬(wàn)，甚至數(shù)百萬(wàn)個(gè)[3]。

細(xì)粒棘球蚴的原頭節(jié)是其包囊中活力最強(qiáng)、感染力最大的結(jié)構(gòu)，如果細(xì)粒棘球蚴的原頭節(jié)在宿主體內(nèi)進(jìn)行繁殖生長(zhǎng)，則可以很快播散并成長(zhǎng)為新的傳播性很強(qiáng)的棘球蚴，所以殺滅原頭節(jié)是殺滅細(xì)粒棘球蚴的重要環(huán)節(jié)及重要靶點(diǎn)，是囊性棘球蚴病的預(yù)防和治療研究的必要環(huán)節(jié)[4-7]。

本實(shí)驗(yàn)證明了利用良性腫瘤的治療劑量(總量40 Gy)的IMRT對(duì)骨細(xì)粒棘球蚴的原頭節(jié)具有很好的殺滅效果，而且酶組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果提示IMRT對(duì)骨細(xì)粒棘球蚴的SDH有明顯的抑制作用。SDH是三羧酸循環(huán)和細(xì)胞呼吸鏈的限速酶，參與細(xì)胞能量代謝及氧利用，是細(xì)胞進(jìn)行代謝和生命活動(dòng)所必需的，其活性的強(qiáng)弱反映三羧酸循環(huán)的活躍程度，可間接反映細(xì)胞有氧糖代謝水平。本實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)IMRT導(dǎo)致骨細(xì)粒棘球蚴的原頭節(jié)內(nèi)部的琥珀酸脫氫酶活性下降，從而導(dǎo)致細(xì)胞的能量代謝功能下降，從而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。本研究結(jié)果還提示細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)，特別是原頭節(jié)吸盤(pán)部位存在較強(qiáng)的琥珀酸脫氫酶活性，而細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的蟲(chóng)體蠕動(dòng)、吸盤(pán)伸縮及肌肉收縮所需能量多數(shù)來(lái)源于三羧酸循環(huán)和呼吸鏈完全氧化，如果IMRT導(dǎo)致骨細(xì)粒棘球蚴的原頭節(jié)內(nèi)部的琥珀酸脫氫酶活性下降，必將影響蟲(chóng)體的活動(dòng)、吸附、游走等運(yùn)動(dòng)，這都將大大降低細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的傳染性、傳播性及繁殖能力。

本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)IMRT對(duì)骨細(xì)粒棘球蚴的原頭節(jié)有很好的殺滅作用，而且其作用機(jī)制可能是通過(guò)改變琥珀酸脫氫酶的活性而實(shí)現(xiàn)的，IMRT作為臨床治療骨細(xì)粒棘球蚴病的新方法，具有探索價(jià)值。

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