陳永勝等

摘要：褐化很大程度上限制了蓖麻花藥增殖培養(yǎng)研究，本研究通過改變蓖麻花藥愈傷組織的培養(yǎng)基成分、添加防褐劑來建立高效增殖體系，最終確定蓖麻花藥愈傷增殖最佳培養(yǎng)基為1/2MS+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+NAA 0.3 mg/L+ZT 5.0 mg/L+脯氨酸750 mg/L+酸性水解酪蛋白750 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+維生素C 400 mg/L+活性炭 0.6 mg/L，pH值=5.8。

關鍵詞：蓖麻；花藥；愈傷組織增殖；防褐化

中圖分類號： S565.604.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0046-02

收稿日期：2013-08-02

基金項目：國家自然科學基金（編號：31060194）。

作者簡介：陳永勝（1971—），男，內蒙古通遼人，博士，教授，主要從事作物生物技術研究。Tel：（0475）8314624；E-mail：chenys-2012@hotmail.com。蓖麻（Ricinus communis L.）為一年生或多年生雙子葉植物，其副產品多用于航空航天、化工、醫(yī)藥、農業(yè)等，市場潛力較大[1]。我國是蓖麻種植第二大國，但蓖麻新品種的開發(fā)一直處于落后水平，近年來才將現(xiàn)代生物技術應用于蓖麻育種[2-3]。蓖麻花藥立體培養(yǎng)所得的植株都是純系，自交后代不發(fā)生性狀分離，在育種上有很高的應用價值。國內蓖麻花藥培養(yǎng)研究起步較晚，且褐化一直是花藥培養(yǎng)過程中的難題，主要表現(xiàn)外植體增殖、誘導初分化或是再分化過程中，自身組織會向培養(yǎng)基釋放褐色物質導致培養(yǎng)基逐漸變褐，外植體也隨之死亡[4-5]。褐化很大程度上限制了蓖麻花藥離體培養(yǎng)的效率，除了本身基因型的差異外，可添加防褐物、調整培養(yǎng)基成分、改變培養(yǎng)環(huán)境等來防止褐化[6-7]。本研究通過改變蓖麻花藥愈傷增殖過程中培養(yǎng)基條件、添加褐化抑制劑，以期有效降低褐化率，建立高質量的蓖麻花藥培養(yǎng)體系。

1材料與方法

1.1試驗材料

通蓖5號蓖麻花藥，采自內蒙古民族大學試驗農場。在溫度較低、日照較弱時，取健壯無病植株上尚未張開且呈淡黃色的蓖麻花蕾。

1.2試驗方法

1.2.1蓖麻花藥愈傷組織誘導蓖麻花藥愈傷組織誘導參照黃鳳蘭等研究成果[8-10]。4 ℃預處理花蕾5 d，流水沖洗30 min，無菌條件下用75%乙醇消毒30 s，HgCl2消毒2 min，無菌水沖洗5次，最后轉至鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中。愈傷誘導培養(yǎng)基為：MS+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+脯氨酸750 mg/L+NAA 0.9 mg/L+6-BA 1.5 mg/L+酸性水解酪蛋白 750 mg/L+抗壞血酸100 mg/L，pH值=5.8。將3/5個花蕾花藥均勻分至培養(yǎng)基表面進行愈傷組織誘導，約230個/瓶。

1.2.2愈傷組織增殖防褐化篩選篩選“1.2.1”節(jié)結果中直徑為3 mm左右、淡綠色致密型的花藥愈傷組織，進行防褐化篩選。每瓶培養(yǎng)基接種愈傷23粒，2次重復，15 d后統(tǒng)計褐化率、增殖率。（1）無機鹽濃度篩選：篩選培養(yǎng)基中的無機鹽濃度（MS、1/2 MS、1/4 MS、1/8 MS、1/16MS），建立適宜的愈傷組織增殖無機鹽環(huán)境。（2）PGR條件篩選：篩選培養(yǎng)基中最佳激素NAA（01、0.3、0.5 mg/L）、ZT（3.0、5.0、7.0 mg/L）、6-BA（0、10、2.0 mg/L）濃度，以提高愈傷增殖的效率。（3）維生素C濃度篩選：添加不同濃度的防褐添加劑維生素C（0、200、400、600、800 mg/L），篩選最適維生素C濃度。（4）活性炭濃度篩選：添加不同濃度的防褐添加劑活性炭（0、03、0.6、0.9、1.2 g/L），篩選最適活性炭濃度。

1.2.3統(tǒng)計方法

1.2.3.1愈傷組織增殖率

愈傷組織增殖率=（m3-m2） -（m1-m0）/（m1-m0）×100%。

式中：m0為繼代前培養(yǎng)基與培養(yǎng)容器質量；m1為繼代后培養(yǎng)基、培養(yǎng)容器與愈傷組織質量；m2為第2次繼代前培養(yǎng)基與培養(yǎng)容器質量；m3為第2次繼代后培養(yǎng)基、培養(yǎng)容器與愈傷組織質量。

1.2.3.2愈傷組織褐化程度統(tǒng)計依次用“+”“++”“+++”“++++”“+++++”表示褐化程度，其中“+++++”褐化最嚴重；依次用“*”“**”“***”“****”調節(jié)褐化程度。

2結果與分析

2.1花藥愈傷組織誘導結果

花藥愈傷組織誘導結果如圖1所示，其中多為淺綠色的致密型愈傷，且褐化不明顯。選取其中直徑為3 mm左右的愈傷組織進行增殖培養(yǎng)。

2.2愈傷組織增殖防褐化篩選結果

2.2.1無機鹽濃度篩選結果由表1可知，當無機鹽濃度為1/2MS時，愈傷增殖率高達29.06%；在各個無機鹽濃度下，愈傷組織的褐化率變化不大。

3結論與討論

褐化是蓖麻花藥培養(yǎng)的主要限制因素，最初愈傷為棕黃色，轉為深褐色后停止生長，最后逐漸死亡。本研究通過改變愈傷組織的培養(yǎng)基成分、添加防褐劑來建立高效蓖麻花藥愈傷增殖體系，當添加400 mg/L維生素C、0.6 g/L活性炭時對增殖培養(yǎng)過程中的愈傷組織起到了積極的防褐作用。最終確定最佳培養(yǎng)基組合為1/2MS+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+脯氨酸750 mg/L+酸性水解酪蛋白750 mg/L+NAA 0.3 mg/L+ZT 5.0 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+維生素C 400 mg/L+活性炭 0.6 mg/L，pH值=5.8。

維生素C可作為抗氧化劑阻止褐變的發(fā)生[11]，但目前維生素C降低愈傷組織褐化率的機理尚不明確，有待進一步研究。近年來對活性炭促進花藥離體培養(yǎng)的報道較多[12-13]，當花藥離體培養(yǎng)時，由于新陳代謝紊亂，會產生多種不利于生長或是有毒的酚類等物質，活性炭具有較強的吸附特性且無選擇性，從而有利于花藥培養(yǎng)進程[14]。但筆者發(fā)現(xiàn)，活性炭僅在一定濃度范圍內降低愈傷組織的褐化程度；當超過一定濃度后，反而不利于愈傷組織生長和防褐化，可能是由于吸附了培養(yǎng)基中的生長調節(jié)物質，其中鐵鹽、維生素等與花藥培養(yǎng)與分化密切相關。由于活性炭吸附的雙重性，所以其調控花藥愈傷生長及防褐化的作用也是雙面的， 更應深入研究其最合

適的作用濃度，以建立更加快捷的蓖麻花藥愈傷增殖培養(yǎng)方法。

參考文獻：

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