林 敏，宋 斌，黃 浩，林群英，李 挺

(廣東省微生物研究所，廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東省華南應用微生物重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣東 廣州 510070)

〈生理生化〉

分枝蟲草子實體生長碳氮源需求及主要成分分析*

林 敏，宋 斌**，黃 浩，林群英，李 挺

(廣東省微生物研究所，廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東省華南應用微生物重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣東 廣州 510070)

研究不同碳源和氮源對分枝蟲草子實體生長的影響，并分析栽培所獲得子實體的主要成分。結果顯示，在本實驗條件下分枝蟲草子實體生長的最佳碳源、氮源分別是甘油、硝酸鉀；其子實體的粗蛋白、粗纖維、粗脂肪和灰分含量分別為17.9%、13.3%、1.02%和2.5%，腺苷、多糖、蟲草素和蟲草酸的含量分別為1.1%、0.01%、0.005%和4.82%，含有17種氨基酸，微量元素鐵、錳、銅、鋅、鎳和鉻含量分別為16.7 mg·g-1、8.0 mg·g-1、9.6 mg·g-1、49.9 mg·g-1、1.4 mg·g-1和0.15 mg·g-1，鉛、砷、汞的含量符合國家食用菌相關標準的要求。研究結果可為分枝蟲草人工栽培技術研究提供有用的參考依據，并顯示分枝蟲草子實體具有潛在應用價值。

分枝蟲草；人工栽培；子實體；碳氮源；成分分析

廣義的蟲草(Cordyceps)種類迄今在全世界已報道超過400種，中國已報道的蟲草也超過了100種[1-3]?，F(xiàn)代研究表明，蟲草屬的許多種類具有抗腫瘤、抗病原、抗氧化以及增強人體免疫功能等多種藥理作用[4，5]，蟲草富含腺苷、蟲草素、蟲草酸等活性成分和多種氨基酸、微量元素、維生素等營養(yǎng)成分[6]。盡管蟲草資源豐富且功效顯著，但被開發(fā)利用的種類還十分有限，僅有冬蟲夏草(C.sinensis)、蛹蟲草(C.militaris)、廣東蟲草(C.guangdongensis)等少數(shù)品種得到栽培應用[7]。分枝蟲草(C.ramosa)主要分布在安徽(模式產地)、福建、甘肅和廣東等省區(qū)，當?shù)孛耖g常利用其治療婦科出血癥，包括崩漏、月經過多、更年期子宮出血、產后惡露不絕和宮內節(jié)育器所致子宮出血等，是中國特有的具有藥用價值的真菌[8,9]。但分枝蟲草野生資源很少，尚未有人工栽培的報道。本文對分枝蟲草子實體進行了不同碳氮源需求試驗與主要營養(yǎng)成分分析，旨在為分枝蟲草資源的開發(fā)利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株GDIM_CR20110521由廣東省微生物研究所微生物資源中心提供，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基礎培養(yǎng)基

1.2.1 PDA培養(yǎng)基

馬鈴薯200 g、瓊脂20 g、葡萄糖20 g，補水至 1 000 mL，pH值為6.5，分裝于500 mL三角瓶，115℃滅菌20 min，冷卻至常溫備用。

1.2.2 液體培養(yǎng)基

葡萄糖10 g、酵母浸膏3 g、麥芽浸出物3 g、蛋白胨5 g，補水至 1 000 mL，pH為6.5，分裝于500 mL三角瓶，115℃滅菌20 min，冷卻至常溫備用。

1.2.3 米飯培養(yǎng)基

大米1 kg，營養(yǎng)液1L～2L，其營養(yǎng)液由葡萄糖20 g·L-1、蛋白胨8 g·L-1、磷酸二氫鉀1 g·L-1、硫酸鎂0.5 g·L-1、維生素B10.5 mg·L-1組成，pH 6.0～6.5，按20 g·瓶-1分裝于栽培瓶，121℃滅菌40 min后冷卻至常溫備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 分枝蟲草栽培試驗

從分枝蟲草斜面上挑取10塊0.5 cm2的菌絲塊，接種裝有100 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，23℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)10 d。用無菌水按1∶3比例稀釋生產菌種，取約10 mL接入米飯培養(yǎng)基中，25℃暗培養(yǎng)10 d，待菌絲長滿培養(yǎng)基后，進行光照(10 h·d-1)培養(yǎng)，14 d后可長出子實體原基，再繼續(xù)培養(yǎng)60 d，待部分子實體頂部變成白色且扁削形或圓形，即進行采收，得到分枝蟲草子實體，并稱鮮重。

1.3.2 不同碳源對分枝蟲草子實體生長的影響

改變米飯培養(yǎng)基中營養(yǎng)液的碳源種類，分別以20 g·L-1可溶性淀粉、麥芽浸出物、糊精、蔗糖、麥芽糖、甘油替代營養(yǎng)液中的葡萄糖，不添加任何碳源的培養(yǎng)基為空白對照。方法同1.3.1。重復3次。考察不同碳源對分枝蟲草子實體生長的影響。

1.3.3 不同氮源對分枝蟲草子實體生長的影響

改變米飯培養(yǎng)基中營養(yǎng)液的氮源種類，分別以20 g·L-1牛肉浸膏、黃豆粉、酵母浸膏、硝酸鉀、甘氨酸、奶粉替代營養(yǎng)液中的蛋白胨，以不含氮源的培養(yǎng)基作為對照。方法同1.3.1。重復3次?？疾觳煌磳Ψ种οx草子實體生長的影響。

1.3.4 分枝蟲草子實體主要營養(yǎng)成分測定

將分枝蟲草子實體于60℃烘干至恒重，粉碎，過20目篩。粗蛋白含量參照GBT5009.5-20106.1第一法測定[10]；粗纖維含量參照GBT5009.10-2003重量法測定[11]；粗脂肪含量參照GBT5009.6-2003重量法(第二法)測定[12]；灰分含量參照GB 5009.4-2010重量法測定[13]；多糖(以葡萄糖計)、腺苷、蟲草素和蟲草酸均參照[14]測定；氨基酸含量參照GBT5009.124-2003進行樣品測定[15]。

1.3.5 分枝蟲草子實體微量元素測定

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據采用SPSS17.0(SPSS Inc.，Chicago, IL)軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同碳源對分枝蟲草子實體生長的影響

不同碳源對分枝蟲草子實體生長的影響見圖1。

圖1結果顯示，不同碳源對分枝蟲草子實體生物轉化率的影響大小分別是甘油>麥芽浸出物>可溶性淀粉>葡萄糖>麥芽糖>糊精>蔗糖，方差分析表明無顯著性差異(p=0.05)。在7種不同的碳源中，甘油最有利于分枝蟲草子實體的生長，生物轉化率為61.66%，子實體外觀最好。而蔗糖最不利于子實體的生長，生物轉化率僅為36.7%，明顯低于空白對照組。

2.2 不同氮源對分枝蟲草子實體生長的影響

不同氮源對分枝蟲草子實體生長的影響見圖2。

分枝蟲草子實體在7種供試的氮源培養(yǎng)基上均能生長，方差分析表明無顯著性差異(p=0.05)。但以黃豆粉為氮源時，對分枝蟲草子實體的生長影響最大，生物轉化率達到59.2%，其次是硝酸鉀為56.99%。黃豆粉為氮源時子實體無法形成獨立的棒狀，顏色偏白。硝酸鉀作氮源時子實體最細長，呈金黃色且形成條形。因此，確定分枝蟲草子實體生長的最佳氮源為硝酸鉀。

2.3 主要營養(yǎng)成分

2.3.1 常見營養(yǎng)活性成分

經測定，分枝蟲草子實體的常見營養(yǎng)成分為粗蛋白17.9%、粗纖維13.3%、粗脂肪1.02%、灰分2.5%。分枝蟲草子實體的活性成分含有多糖1.1%、蟲草素0.005%、蟲草酸4.82%、腺苷0.01%和蟲草酸4.82%。

2.3.2 氨基酸組成與含量

分枝蟲草子實體的主要17種氨基酸含量見表1。

表1 分枝蟲草子實體氨基酸組成與含量

注：*表示必需氨基酸。

氨基酸總含量為12.392 mg·g-1，其中必需氨基酸總含量3.812 mg·g-1。

2.3.3 微量元素含量

分枝蟲草子實體的微量元素含量情況見表2。

表2 分枝蟲草子實體微量元素含量

注：-表示低于檢測最低限量。

從表2可以看出，鐵、錳、銅、鋅、鎳和鉻含量分別為16.7 mg·g-1、8.0 mg·g-1、9.6 mg·g-1、49.9 mg·g-1、1.4 mg·g-1和0.15 mg·g-1，鉛、砷、汞的含量符合國家食用菌相關標準的要求[25]。

3 小結與討論

分枝蟲草子實體生長的最佳碳源、氮源分別為甘油和硝酸鉀。子實體的粗蛋白、粗纖維、粗脂肪、灰分含量分別為17.9%、13.3%、1.02%、2.5%；腺苷、多糖、蟲草素、蟲草酸含量分別為1.1%、0.01%、0.005%、4.82%，其中蟲草素含量與冬蟲夏草的含量相近[26]，腺苷含量達到《中國藥典》(2005)的要求[27]；氨基酸含量雖與廣東蟲草、冬蟲夏草、蛹蟲草、九州蟲草的含量互有差異[28]，但含有17種氨基酸，種類齊全；而重金屬鉛、砷、汞的含量則在國家規(guī)定的食用菌安全標準范圍之內[29，30]。

試驗結果顯示，分枝蟲草是1種具有潛在商業(yè)應用價值的珍稀蟲草品種，值得進一步深入研究。

[1] Sung GH, Hywel-Jones NL, Sung JM, et al. Phylogenetic classification ofCordycepsand the clavicipitaceous fungi[J]. Stud. Mycol., 2007(57): 5-59

[2] CABI. Bioscience and CBS Database of Fungal Names [EBOL]. 2014-10-10[2012-08-16].http:www.indexfungorum.org.

[3] 宋斌, 林群英, 李泰輝，等. 中國蟲草屬已知種類及其分布[J]. 菌物研究，2006，4(4)：10-26.

[4] 梁宗琦. 中國真菌志(第32卷，蟲草屬)[M]. 北京：科學出版社，2007：1-190

[5] 曾宏彬，宋斌，李泰輝. 蛹蟲草研究進展及其產業(yè)化前景[J]. 食用菌學報，2011，8(2)：70-74.

[6] 傅嵐，陳作紅. 蟲草屬真菌化學成分及藥理作用研究進展[J]. 生命科學研究，2004，8(1)：1-7.

[7] 李春如，南圣姬，耿德貴，等. 十七種蟲草的子實體培育研究[J]. 菌物學報，25(4)：639-645，2006

[8] 鄧叔群. 中國的真菌[M]. 北京：科學出版社，1964：1-808.

[9] 黃年來. 中國大型真菌原色圖鑒[M]. 北京：中國農業(yè)出版社, 1998:1-293.

[13] GB5009.4-2010，食品中灰分的測定[S].

[14] 馬鶯，王靜，牛天嬌. 功能性食品活性成分測定[M]. 北京：化學工業(yè)出版社，2005：1-342.

[26] 林群英，李泰輝，宋斌，等. 廣東蟲草與冬蟲夏草及蛹蟲草的成分比較[J]. 食用菌學報，2009，16(4)：54-57

[27] 國家藥典委員會. 中國藥典Ⅰ部[M]. 北京：化學工業(yè)出版社，2005：75.

[28] 張海英，凌建亞，張長鎧. 九州蟲草與冬蟲夏草、蛹蟲草氨基酸成分比較[J]. 德州學院學報，2005，21(6)：31-34

[29] 中華人民共和國衛(wèi)生部. 保健食品檢驗與評價技術規(guī)范[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：246-310.

[30] GB7096-2003，食用菌衛(wèi)生標準[S].

Study on Carbon and Nitrogen Requirements for the Fruitbody Growth and Analysis on Main Components ofCordycepsramosa

LIN Min, SONG Bin, HUANG Hao, LIN Qun-ying, LI Ting

(Guangdong Institute of Microbiology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, State Key Laboratory of Applied Microbiology, Ministry-Guangdong Province Jointly Breeding Base, Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology, South China, GuangzhouGuangdong510070)

Effects of carbon sources and nitrogen sources on the fruitbody growth ofCordycepsramosawere determined, and main components of fruitbodies were analyzed. The results showed that the optimal carbon and nitrogen sources were glycerol and KNO3respectively under the experimental condition. And the contents of crude protein, crude fiber, crude fat and ash in its fruit bodies from artificial cultivation were 17.9%, 13.3%, 1.02%, 2.5% respectively. The contents of adenosine, polysaccharide, cordycepin, cordycepic acid inCordycepsramosafruit bodies were 1.1%, 0.01%, 0.005% and 4.82% respectively. And 17 kinds of amino acids were detected from the fruit bodies. The microelement levels, such as Fe, Mn, Cu, Zn, Ni, Cr were 16.7 mg·g-1, 8.0 mg·g-1, 9.6 mg·g-1, 49.9 mg·g-1, 1.4 mg·g-1and 0.15 mg·g-1respectively. Levels of the heavy metals, such as Pb, As and Hg, met the edible fungus safety standard levels specified by the Ministry of Health of the People’s Republic of China. The results could provide useful references for further optimization of artificial cultivation ofCordycepsramosa, and indicated that fruitbodies ofCordycepsramosahad potential application value.

Cordycepsramosa; Cultivation; fruitbody; Carbon and nitrogen sources; Components analysis

*項目來源：粵科技項目“野生分枝蟲草人工栽培技術研究”，項目編號：2011B020303003；粵科技成果轉化項目“蛹蟲草產業(yè)化技術應用與示范”，項目編號：2012NL031；穗科技項目“我國特有種分枝蟲草優(yōu)質高產培育關鍵技術研究”，項目編號：201300000031；中科院微生物研究所真菌學國家重點實驗室項目“中國重要食藥用菌資源多樣性及保護研究”，項目編號：SKLM(2013-2015)。

林敏(1983-)，女，助理研究員，主要從事真菌資源開發(fā)利用研究。

**通信作者： 宋斌，研究員，E-mail: ganoderma@vip.163.com

2014-09-11

S646.9

A

1003-8310(2014)06-0043-03