胡曉強 ，李 峰 ，趙建選 ，靳榮線

(1.農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點實驗室，北京 100081； 2.河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

1株野生平菇菌株的采集及其馴化栽培*

胡曉強1，2，李 峰2，趙建選2，靳榮線2

(1.農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點實驗室，北京 100081； 2.河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

采集到1株野生平菇菌株，對其子實體進行了組織分離，測定了菌絲長勢及吃料能力，經(jīng)ITS分子標記技術(shù)鑒定為弗羅里達側(cè)耳；經(jīng)馴化栽培，成功出菇，味道鮮美，對開發(fā)利用野生真菌資源具有重要的意義。

弗羅里達側(cè)耳；ITS；人工馴化；野生真菌資源

我國地域遼闊，自然氣候條件復雜，生態(tài)類型多樣，是世界上高度生物多樣性的12個國家之一。據(jù)科學家估計，地球上有生物約500萬種，其中菌物約150萬種，我國至少有菌物10萬種，其中已知菌物不足1萬種[1]。新鄉(xiāng)太行山區(qū)屬于暖溫帶大陸性季風氣候，四季分明，植被種類豐富，具有豐富的野生真菌資源，開展野生資源調(diào)查，進一步摸清本地區(qū)的野生真菌資源現(xiàn)狀，對野生真菌資源的開發(fā)及保護將具有巨大意義[2]。

筆者在2011年野外大型真菌資源調(diào)查研究中，采集到1株野生平菇菌株，經(jīng)ITS分子標記技術(shù)鑒定為弗羅里達側(cè)耳，其可供食用，并進行了馴化栽培，成功出菇。

1 材料與方法

1.1 野生子實體材料

1.1.1 標本采集

河南省新鄉(xiāng)市紅旗區(qū)新二街街道兩側(cè)景觀樹(洋槐)樹杈上，采集到1株野生平菇菌株，對其進行了現(xiàn)場拍照，并成功對子實體進行了組織分離，菌株現(xiàn)保藏于新鄉(xiāng)市農(nóng)科院食用菌研究所菌種室，菌株編號為Pl.o038。

1.1.2 子實體形態(tài)特征觀察

肉眼觀測野生子實體和人工栽培子實體的外表形態(tài)，包括菌肉、菌蓋、菌褶、生長環(huán)境等因素。

1.1.3 菌絲生長勢測定

采集到的野生菌株經(jīng)組織分離后，置于25℃恒溫條件下黑暗培養(yǎng)5 d，在距離菌絲尖端1 cm左右位置，挑取菌種塊轉(zhuǎn)入新的CPDA培養(yǎng)基上重新活化，記錄菌絲滿管時間；將已活化的CPDA菌種轉(zhuǎn)入原種培養(yǎng)基，觀察菌絲長勢，記錄菌絲滿瓶時間；選擇長勢較好的原種瓶，將菌種接入栽培培養(yǎng)基，觀察菌絲吃料能力及長勢，記錄菌絲滿袋時間。

1.2 培養(yǎng)基質(zhì)制備

母種培養(yǎng)基：CPDA綜合培養(yǎng)基，土豆200 g、蔗糖20 g、硫酸鎂0.5 g、磷酸二氫鉀2 g、瓊脂條20 g，調(diào)水至1 L。

原種培養(yǎng)基：麥粒棉籽殼培養(yǎng)基，麥粒預煮30 min～45 min至麥粒無白心，瀝出多余水分， 添加預發(fā)酵的棉籽殼1%、石膏1%，裝瓶，高壓滅菌。

栽培培養(yǎng)基：玉米芯50%、棉籽殼46%、鈣鎂磷肥2%、尿素1%、石灰1%，預發(fā)酵3 d后，常壓滅菌，熟料栽培。

1.3 栽培管理

挑選長勢健壯的原種，接種24袋栽培培養(yǎng)基，接種完成后，置于20℃～25℃培養(yǎng)室避光培養(yǎng)，濕度低于75%。

菌絲長滿栽培袋后，移入出菇棚內(nèi)出菇，出菇棚溫度為24℃～35℃，增加空氣濕度至85%～95%，刀片在菌袋兩側(cè)劃出2 cm～3 cm出菇孔，等待出菇。

1.4 rDNA ITS區(qū)擴增

1.4.1 DNA提取

按照CTAB法提取菌絲體DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA提取質(zhì)量，條帶單一，亮度均勻，稀釋至合適濃度后備用[3，4]。

1.4.2 PCR擴增

采用引物ITS4( 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) 和ITS5(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)，以已提取DNA為模板，擴增該平菇菌株的核糖體DNA片段；反應體系為50 μL，包括10 × PCR緩沖液5 μL，25 mmol·L-1MgCl25 μL，引物ITS4(10 μmol·L-1)和ITS5(10 μmol·L-1)各1 μL，10 mmol·L-1dNTPY 2 μL，5 U·μL-1TaqDNA聚合酶0.4 μL，基因組DNA 1 μL，雙蒸滅菌水補齊至50 μL。PCR反應程序：95℃預變性2 min后，95℃變性1 min，53℃復性1 min，72℃延伸2 min，進行34個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物在1.4%瓊脂糖凝膠中電泳分離后，膠回收試劑盒(生工)回收擴增片段[3-5]。

1.4.3 PCR測序

ITS擴增片段經(jīng)膠回收后送上海生工公司進行雙向測序，測序結(jié)果經(jīng)比對拼接后確定最終序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 子實體形態(tài)特征

野生子實體菌蓋直徑5.3 cm～8.5 cm，表面干枯，有干狀龜裂，肉質(zhì)致密，淡黃色至白色，邊緣齒輪狀裂痕，菌褶稀疏，直生，菌柄1 cm～4 cm，側(cè)生，基部稍膨大，表面光滑。人工栽培子實體菌蓋直徑6 cm～11 cm，白色，質(zhì)地薄、柔軟、堅韌，菌柄細，長1 cm～4 cm，菌褶稀疏，側(cè)生，孢子印白色，子實體幼時為灰黑色，菌蓋展開后漸為白色，子實體照片見圖1。

2.2 菌絲生長勢

菌株產(chǎn)量及生長勢情況見表1。

表1 菌株產(chǎn)量及生長勢

注：+++表示菌絲生長旺盛；++表示菌絲生長稀疏；+表示菌絲萌發(fā)；-表示菌絲未萌發(fā)。

由表1可見，菌絲體長勢旺盛，在CPDA培養(yǎng)基上平均8 d可長滿試管，原種瓶培養(yǎng)時間為25 d，栽培袋培養(yǎng)40 d即可滿袋，菌絲抗雜菌能力強，沒有出現(xiàn)菌袋污染現(xiàn)象。

2.3 出菇特性

在塑料大棚條件下，出菇棚日平均溫度28℃，一般菌袋在移入出菇棚后5 d～10 d即可出現(xiàn)原基，原基發(fā)生1 d后即可采收第1潮菇。第1潮菇平均每袋產(chǎn)量 0.1 979 kg，生物學效率44%。

2.4 ITS序列

測得的野生菌株ITS序列片段長度為653 bp，并將其與數(shù)據(jù)庫序列比對，確定其為佛羅里達側(cè)耳，見圖2。

圖2 佛羅里達側(cè)耳序列片段

3 討論

采集到的野生菌株菌絲體表現(xiàn)出了側(cè)耳屬平菇菌絲長勢旺盛、抗雜能力強的特性[6]，本馴化栽培試驗采用的是先將栽培基質(zhì)發(fā)酵，然后常壓滅菌進行熟料栽培，根據(jù)其平菇的栽培特性，采用玉米芯發(fā)酵料進行出菇還有待進一步試驗。

該野生菌株的采集時間為6月份，出菇試驗期間最高氣溫在35℃左右，表明該菌株為高溫型或耐高溫型菌株，其子實體白色，質(zhì)柔軟堅韌，較生產(chǎn)中采用的高溫型平菇(質(zhì)地脆，易碎)更耐儲運，是較好的遺傳種質(zhì)資源。本試驗人工栽培成功后，收集了該野生菌株的孢子印，采用雜交手段，將其與生產(chǎn)菌株進行配對雜交，為全面開發(fā)馴化野生菌株的潛力做好前期準備。

野生菌種質(zhì)資源的收集和鑒定是食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一項基礎性研究工作，按照胡清秀[7]關于中國山區(qū)菌物資源區(qū)的劃分，新鄉(xiāng)太行山屬于暖溫帶落葉闊葉林山地菌物區(qū)，區(qū)內(nèi)植被以落葉闊葉林、闊葉林以櫟類為主、針葉林有赤松、黑松、油松等。菌物資源特征以棕灰口蘑、蜜環(huán)菌、血紅鉚釘菇、毛頭鬼傘、羊肚菌、褐疣柄牛肝菌為主，開展野生資源調(diào)查，對發(fā)掘和保護野生食(藥)用菌種質(zhì)資源具有重要意義。

傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定，由于野生大型真菌子實體受生長環(huán)境、生長時期等客觀因素的影響較大，形態(tài)性狀的選取和判斷受主觀因素影響較大，所以基于形態(tài)性狀特征對大型真菌進行分類鑒定具有一定的局限性。ITS序列是位于rDNA編碼基因18s、5.8s、28s之間的小基因片段，其在生物進化過程中承受的自然選擇壓力小，能夠容忍更多的變異，在絕大多數(shù)的真核生物中表現(xiàn)出極為廣泛的序列多態(tài)性。ITS序列分析在判斷大型真菌的親緣關系、遺傳地位及系統(tǒng)發(fā)育方面提供了巨大的便利[8]。

本試驗對擴增到的ITS片段進行了測序，通過NCBI數(shù)據(jù)庫的比對，找到其與弗羅里達側(cè)耳的相似度達99%以上，基本可以確定該野生菌株為弗羅里達側(cè)耳。ITS序列分析技術(shù)在野生菌株的鑒定方面有著巨大的應用價值。

[1]袁明生，孫佩瓊. 中國蕈菌原色圖集[M]. 成都：四川科學技術(shù)出版社，2007.

[2]李忠民，杜適普，賀德先，等. 三門峽市野生真菌資源調(diào)查與生態(tài)區(qū)劃研究[J].河南農(nóng)業(yè)大學學報，2007，41(5)：551-555.

[3]劉偉. 大型真菌菌絲體分離、培養(yǎng)及其rDNA分子鑒定研究[D]. 石河子：石河子大學，2009.

[4]趙杏利，鄧暉，牛永春，等. 一種狗尾草病院真菌的鑒定及菌株致病性研究[J]. 菌物學報，2010，29(2)：172-177.

[5]李傳華，章爐軍，譚琦，等. 野生擬粘小奧德蘑馴化和栽培研究[J]. 食用菌學報，2012，19(3)：45-48.

[6]王呈玉. 中國側(cè)耳屬[Pleurotus(Fr.)Kumm.]真菌系統(tǒng)分類學研究[D]. 吉林農(nóng)業(yè)大學.2004.

[7]胡清秀，吳永堂，胡志全. 中國山區(qū)菌物資源區(qū)劃[J]. 中國農(nóng)業(yè)資源與區(qū)劃，2008，29(4)：39-43.

[8]許峰，劉宇，王守現(xiàn)，等. 一株野生大型真菌的分離與鑒定[J]. 中國農(nóng)學通報，2012，28(13)：176-179.

Collection and Domesticated Cultivation of a Wild Mushroom Strain

HU Xiao-qiang1，2, LI Feng2, ZHAO Jian-xuan2, JIN Rong-xian2

(1.Key Laboratory of Microbial Resources Collection and Preservation, Ministry of Agriculture, Beijing100081; 2.Institute of Edible Fungi, Henan, Xinxiang Academy of Agricultural science, XinxiangHenan453003)

A wild mushroom strain were collected, and tissue separation were carried out. Its growth potential and digest ability were determinated, and via ITS molecular marker technology appraisal, it belonged to thePleurotusfloridanusstrain. It fruited successfully by domesticated cultivation, and tasted delicious, which had the vital significance for the development and utilization of wild fungus resources.

Pleurotusfloridanusstrain; ITS; Domesticated cultivation; Wild mushroom resource

*項目來源：農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點實驗室資助；河南省食用菌產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(z2010-03-05)。

胡曉強(1984-)，男，助理研究員，主要從事食用菌育種及栽培技術(shù)研究。

2014-09-30

S646.1

A

1003-8310(2014)06-0013-03