文普帥，高 靜遼寧醫(yī)學院病理生理學教研室，遼寧錦州 000；遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 超聲科，遼寧錦州000

ARRB1融合蛋白表達載體ARRB1-EGFP的構建及其在神經膠質瘤細胞中的表達

文普帥1，高 靜21遼寧醫(yī)學院病理生理學教研室，遼寧錦州 121000；2遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 超聲科，遼寧錦州121000

目的 構建重組表達載體ARRB1-EGFP，在細胞中表達與鑒定，為進一步研究其功能奠定基礎。方法 RT-PCR獲得編碼人ARRB1的全基因序列，克隆到真核表達載體pEGFPN1，構建重組表達載體ARRB1-EGFP，并轉化于E.coli DH5α中篩選陽性重組子，通過限制性內切酶酶切電泳鑒定和DNA序列測定正確后，轉染入HEK293細胞中表達，表達產物經Western blot檢測蛋白的特異性，應用免疫熒光方法比較融合蛋白與內源性ARRB1在SNB19細胞的定位。結果 成功構建了ARRB1融合蛋白的真核表達載體，并經Western blot鑒定正確。免疫熒光提示融合蛋白與內源性ARRB1定位相似。結論 ARRB1-EGFP融合蛋白可以安全、高效地轉導入HEK293以及SNB19細胞中。

ARRB1蛋白；載體構建；表達；融合蛋白

ARRB1(β-arrestin1)是Arrestin家族成員之一，在全身各組織廣泛表達，在腦和脾組織中表達最多，分布于細胞質和細胞核中[1-2]。最初發(fā)現，ARRB家族能夠負向調節(jié)GPCR受體信號通路[3]。后續(xù)研究表明，該家族作為內吞適配器、信號轉導子以及支架蛋白可以調控細胞多種生理功能，例如調節(jié)Wnt、TGFB、Notch與IGF-1受體等信號通路，調節(jié)細胞骨架，參與轉錄調控等[4-13]。也有報道發(fā)現ARRB1能夠調節(jié)腫瘤的增殖、存活、遷移以及腫瘤血管發(fā)生等行為[14-22]。近年來的研究表明ARRB1在腫瘤組織中異常表達。Li等[23]發(fā)現，在乳腺癌和黑色素瘤細胞中ARRB1的mRNA水平明顯增高；而Michal等[21]的結果恰恰相反，發(fā)現ARRB1水平降低，并與患者的不良預后呈正相關。本文構建了含有ARRB1和增強型綠色熒光蛋白融合蛋白的表達質粒，成功在細胞內表達，并觀察到與內源性ARRB1相似的定位，為深入探討ARRB1在神經膠質瘤細胞中的作用奠定基礎。

材料和方法

1 材料和試劑 載體pEGFPN1購自Addgene公司；人胚腎細胞HEK293和神經膠質瘤SNB19細胞由中國科學院生物物理研究所提供；PCR回收試劑盒、質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自康為世紀公司；XhoⅠ、HindⅢ、EcoRI、T4 DNA連接酶以及Phusion超保真DNA聚合酶購自NEB公司；核酸相對分子質量標準參照物(DM2000和1K) (康為世紀)，蛋白預染標準參照物均為美國Fermentas公司產品；質粒轉染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；感受態(tài)大腸埃希菌DH5α購自全式金公司；寡核苷酸引物合成及DNA序列測定由華大基因公司完成；ARRB1多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司、辣根酶標記山羊抗兔IgG二抗、FITC標記山羊抗兔IgG(H+L)二抗購自Invitrogen公司。

2 ARRB1基因引物設計與擴增 用RT-PCR從人胚腎細胞的poly(A+)RNA中擴增ARRB1的cDNA，兩端分別引入XhoⅠ和HindⅢ酶切位點。上游引物：5'-TATCTCGAGGCCACCATGGGCGACAAAGG GACC-3'；下游引物：5'-TATAAGCTTTCTGTTGTT GAGCTGTGG。PCR擴增條件：95℃預變性5 min，然后95℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸2 min，循環(huán)35次后，72℃保溫10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增結果。

3 ARRB1-EGFP載體的構建 ARRB1基因PCR擴增產物及載體pEGFPN1經XhoⅠ和HindⅢ雙酶切后應用瓊脂糖凝膠DNA回試劑盒純化回收，在T4連接酶的作用下16℃連接過夜后，轉化DH5α感受態(tài)，在卡那霉素陽性細菌平板篩選出單個陽性克隆，提取細菌質粒行EcoRI單酶切鑒定，并送華大基因公司測序。待測序正確后，再大量提取該質粒，命名為ARRB1-EGFP。

4 ARRB1-EGFP融合蛋白的表達及Western blot檢測 利用LipofectamineTM2000將ARRB1-EGFP及對照質粒pEGFPN1分別轉染HEK293細胞，6 ～8 h后更換新鮮培養(yǎng)基，轉染24 h后收集細胞，提取蛋白進行蛋白質印跡，以抗GFP多克隆抗體為一抗，以HRP標記的羊抗兔IgG為二抗檢測融合蛋白的表達。

5 ARRB1-EGFP融合蛋白及內源ARRB1在細胞內定位的比較 將ARRB1-EGFP質粒轉染至SNB19細胞中，36 h后棄培養(yǎng)基，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定細胞30 min，PBS洗3次，DAPI室溫5 min，PBS洗3次，封片，熒光顯微鏡觀察。免疫熒光檢測內源ARRB1時，常規(guī)固定、封閉后，加入抗ARRB1多克隆抗體(濃度為1∶500)，4℃孵育過夜，PBS洗3次，加入山羊抗兔IgGFITC(濃度為1∶500)，37℃孵育1 h，PBS洗3次，DAPI室溫5 min，PBS洗3次，封片，熒光顯微鏡觀察。

結 果

1 ARRB1基因的擴增 經RT-PCR反應后，1%瓊脂糖凝膠電泳見約1.3 kb處有亮帶，與預計ARRB1基因片段大小相符。見圖1。

2 ARRB1-EGFP的酶切鑒定及測序報告 挑取單個白色菌斑，擴大培養(yǎng)后小量提取質粒，由于載體pEGFPN1和距ARRB1基因其實位點483 bp處存在EcoRI位點，所以，質粒經EcoRI酶切鑒定，酶切后產生5 126 bp和785 bp的兩個條帶，分別為載體和ARRB1基因片段(圖2)，說明酶切片段的大小和插入方向均與預計相同，將鑒定正確的菌液送華大基因公司進行測序，利用NCBI的BLAST服務器將測序結果與基因庫中已登記的ARRB1序列進行比對分析，同源性達到100%，以上結果均表明表達載體ARRB1-EGFP構建成功。

圖 1 ARRB1基因的PCR擴增M： DM2000標準參照物；1： ARRB1基因Fig. 1 Application of ARRB1gene by RT-PCRM: DM2000 DNA ladder; 1: ARRB1 Gene

圖 2 ARRB1-EGFP融合蛋白載體的酶切鑒定M1： DM2000標準參照物； 1： ARRB1-EGFP融合蛋白載體； M2： 1K標準參照物Fig. 2 Restriction enzyme digestion of ARRB1-EGFP vector M2: DM2000 DNA ladder； 1： ARRB1-EGFP fusion protein vector；M2:1K DNA

3 ARRB1-EGFP融合蛋白在HEK293細胞中的表達 將ARRB1-EGFP質粒轉染至HEK293細胞，24 h后提取蛋白，經蛋白免疫印跡檢測在相對分子質量80 kU附近檢測到一特異性條帶，與預期的融合蛋白大小一致(圖3)。上述結果顯示成功在HEK293細胞中特異表達ARRB1-EGFP融合蛋白。

4 ARRB1-EGFP融合蛋白與內源性ARRB1細胞內定位比較 重組質粒轉染24 h后，通過熒光顯微鏡觀察，可檢測到ARRB1胞質區(qū)域內有強烈的綠色熒光表達，同時細胞核內也有熒光表達，與內源性ARRB1的亞細胞定位相似，提示ARRB1-GFP能夠在神經膠質瘤中表達良好。見圖4。

圖 3 蛋白質印跡檢測ARRB1-EGFP融合蛋白的表達Fig. 3 Expression of ARRB1-EGFP d e t e c t e d b y Western blot

圖 4 免疫熒光檢測ARRB1-EGFP在神經膠質瘤SNB19細胞中的表達與定位A： FITC標記的內源性ARRB1； B： DAPI標記的細胞核； C：綠色與藍色熒光重疊雙染； D： 融合蛋白ARRB1-EGFP熒光； E： DAPI標記的細胞核； F： 綠色與藍色熒光重疊雙染；標尺： 25 μmFig. 4 Expression and localization of ARRB1-EGFP in SNB19 cells detected by immunofluorescenceA: FITC- labled endogenous ARRB1; B: DAPI- labled nucleus; C: merge of A and B; D: fluorescence of fusion protein ARRB1-EGFP; E: DAPI- labled nucleus; F： merge of D and E; scale bar: 25 μm

討 論

Benovic等[24]從牛腦中純化能夠引起G蛋白偶聯(lián)受體(G Protein-Coupled Receptors，GPCRs)脫敏的β-腎上腺素受體激酶(beta adrenergic receptor kinase，βARK)時發(fā)現，β-ARK的純度越高引起β2-腎上腺素能受體脫敏的作用越弱，猜測存在一種對調節(jié)GPCRs脫敏起至關重要的蛋白質。隨后即發(fā)現了ARRB1以及家族其他成員，從而開始了對ARRB家族的功能學研究。近幾年研究發(fā)現ARRB1在多種腫瘤組織中存在異常表達，并與患者預后相關[21,23]。另外，有研究表明ARRB1參與調節(jié)腫瘤細胞的惡性生物學行為：Buchanan等[25]發(fā)現ARRB1能夠與前列腺素E受體和c-Src形成信號轉導復合物，進而轉錄激活表皮生長因子受體和下游分子Akt，從而調節(jié)結直腸癌細胞的遷移。Feigin等[20]發(fā)現表達ARRB1顯性負性突變體能夠降低PAR-2引起的細胞遷移，沉默ARRB1能夠降低MDA MB-231細胞基礎遷移能力。此外，ARRB1轉基因小鼠血漿中VEGF濃度以及腫瘤組織中新生血管形成高于對照組[22]。這些研究結果提示ARRB1參與調節(jié)腫瘤遷移、血管形成等過程。然而，ARRB1在神經膠質瘤中的研究鮮有報道。

我們未發(fā)表的實驗結果表明：ARRB1在神經膠質瘤中表達降低，并與患者生存時間存在相關性，為了研究ARRB1在神經膠質瘤中的生物學功能，根據ARRB1 cDNA序列，本研究設計正反向特異性引物，并在引物中加入XhoⅠ和HindⅢ酶切位點，以HEK293細胞的cDNA為模板，擴增出ARRB1 cDNA全長序列，成功克隆ARRB1-EGFP真核表達載體，經免疫印跡鑒定了ARRB1-EGFP融合蛋白的表達。并對比了ARRB1-EGFP與內源ARRB1在神經膠質瘤細胞中的定位，這些結果表明成功構建并表達了ARRB1-EGFP重組蛋白。本研究構建的ARRB1-EGFP重組質粒具有以下優(yōu)點：1)選用帶有報告基因的pEGFPN1質粒，可編碼增強綠色熒光蛋白，具有熒光強、分子量較小、對宿主細胞無毒性、檢測方便、不影響目的基因的表達及其后續(xù)的生物活性等優(yōu)點；2)該質粒具有Neo基因，可以采用G418來篩選已成功轉染了該質粒的靶細胞。

本研究構建的ARRB1-EGFP重組蛋白可用于體外或在體水平觀察ARRB1對神經膠質瘤的影響，為探討ARRB1在神經膠質瘤中的作用以及研究ARRB1新的相互作用蛋白及其信號轉導通路奠定了基礎。

1 Sterne-Marr R， Gurevich VV， Goldsmith P， et al. Polypeptide variants of beta-arrestin and arrestin3［J］. J Biol Chem， 1993， 268（21）： 15640-15648.

2 Oakley RH， Laporte SA， Holt JA， et al. Differential affinities of visual arrestin， beta arrestin1， and beta arrestin2 for G proteincoupled receptors delineate two major classes of receptors［J］. J Biol Chem， 2000， 275（22）： 17201-17210.

3 Ferguson SS， Downey WE， Colapietro AM， et al. Role of betaarrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization［J］. Science， 1996， 271（5247）： 363-366.

4 Kríz V， Pospíchalová V， Masek J， et al. β-arrestin promotes wnt-induced low density lipoprotein receptor-related protein 6 （Lrp6）phosphorylation via increased membrane recruitment of Amer1 protein［J］. J Biol Chem， 2014， 289（2）： 1128-1141.

5 Bonnans C， Flacelière M， Grillet F， et al. Essential requirement for β-arrestin2 in mouse intestinal tumors with elevated Wnt signaling［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2012， 109（8）： 3047-3052.

6 Mythreye K， Knelson EH， Gatza CE， et al. TβRIII/β-arrestin2 regulates integrin α5β1 trafficking， function， and localization in epithelial cells［J］. Oncogene， 2013， 32（11）： 1416-1427.

7 Puca L， Chastagner P， Meas-Yedid V， et al. Α-arrestin 1（ARRDC1） and β-arrestins cooperate to mediate Notch degradation in mammals［J］. J Cell Sci， 2013， 126（Pt 19）： 4457-4468.

8 Spartà A， Baiula M， Campbell G， et al. beta-Arrestin 2-mediated heterologous desensitization of IGF-IR by prolonged exposure of SHSY5Y neuroblastoma cells to a mu opioid agonist［J］. FEBS Lett，2010， 584（16）： 3580-3586.

9 Zheng H， Shen H， Oprea I， et al. β-Arrestin-biased agonism as the central mechanism of action for insulin-like growth factor 1 receptortargeting antibodies in ewing’s sarcoma［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2012， 109（50）： 20620-20625.

10 Barnes WG， Reiter E， Violin JD， et al. beta-Arrestin 1 and galphaq/11 coordinately activate RhoA and stress fiber formation following receptor stimulation［J］. J Biol Chem， 2005， 280（9）：8041-8050.

11 Zoudilova M， Kumar P， Ge L， et al. Beta-arrestin-dependent regulation of the cofilin pathway downstream of protease-activated receptor-2［J］. J Biol Chem， 2007， 282（28）： 20634-20646.

12 Gao H， Sun Y， Wu Y， et al. Identification of beta-arrestin2 as a G protein-coupled receptor-stimulated regulator of NF-kappaB pathways［J］. Mol Cell， 2004， 14（3）： 303-317.

13 Witherow DS， Garrison TR， Miller WE， et al. beta-Arrestin inhibits NF-kappaB activity by means of its interaction with the NF-kappaB inhibitor IkappaBalpha［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2004， 101（23）： 8603-8607.

14 Jin G， Westphalen CB， Hayakawa Y， et al. Progastrin stimulates colonic cell proliferation via CCK2R- and β-arrestin-dependent suppression of BMP2［J］. Gastroenterology， 2013， 145（4）：820-30.e10.

15 Raghuwanshi SK， Nasser MW， Chen X， et al. Depletion of betaarrestin-2 promotes tumor growth and angiogenesis in a murine model of lung cancer［J］. J Immunol， 2008， 180（8）： 5699-5706.

16 Sun X， Zhang Y， Wang J， et al. Beta-arrestin 2 modulates resveratrol-induced apoptosis and regulation of Akt/GSK3？pathways［J］. Biochim Biophys Acta， 2010， 1800（9）： 912-918.

17 Wu JX， Shan FX， Zheng JN， et al. β-arrestin promotes c-Jun n-terminal kinase mediated apoptosis via a GABA（B）R·βarrestin·JNK signaling module［J］. Asian Pac J Cancer Prev，2014， 15（2）： 1041-1046.

18 Rosanò L， Cianfrocca R， Masi S， et al. Beta-arrestin links endothelin A receptor to beta-catenin signaling to induce ovarian cancer cell invasion and metastasis［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2009， 106（8）： 2806-2811.

19 Kim JI， Lakshmikanthan V， Frilot N， et al. Prostaglandin E2 promotes lung cancer cell migration via EP4-betaArrestin1-c-Src signalsome［J］. Mol Cancer Res， 2010， 8（4）： 569-577.

20 Feigin ME， Xue B， Hammell MC， et al. G-protein-coupled receptor GPR161 is overexpressed in breast cancer and is a promoter of cell proliferation and invasion［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2014，111（11）： 4191-4196.

21 Michal AM， Peck AR， Tran TH， et al. Differential expression of arrestins is a predictor of breast cancer progression and survival［J］. Breast Cancer Res Treat， 2011， 130（3）： 791-807.

22 Zou L， Yang R， Chai J， et al. Rapid xenograft tumor progression in beta-arrestin1 transgenic mice due to enhanced tumor angiogenesis［J］. FASEB J， 2008， 22（2）： 355-364.

23 Li TT， Alemayehu M， Aziziyeh AI， et al. Beta-arrestin/Ral signaling regulates lysophosphatidic acid-mediated migration and invasion of human breast tumor cells［J］. Mol Cancer Res， 2009， 7（7）：1064-1077.

24 Benovic JL， Kühn H， Weyand I， et al. Functional desensitization of the isolated beta-adrenergic receptor by the beta-adrenergic receptor kinase： potential role of an analog of the retinal protein arrestin （48-kDa protein）［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 1987， 84（24）：8879-8882.

25 Buchanan FG， Gorden DL， Matta P， et al. Role of beta-arrestin 1 in the metastatic progression of colorectal cancer［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2006， 103（5）： 1492-1497.

Construction of ARRB1-EGFP fusion protein and its expression in glioma cells

WEN Pu-shuai1, GAO Jing21Department of Pathophysiology, Liaoning Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China;2Department of Ultrasound, The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China

GAO Jing. Email: gaojinggg@163.com

Objective To construct the recombinant expression vector ARRB1-EGFP, identify its expression in cells, and lay foundations for further functional study. Methods The full gene sequence encoding human ARRB1 was obtained by RT-PCR and subcloned into the eukaryotic expression vector pEGFPN1. Recombinant expression vector, ARRB1-EGFP, was transformed into E.coli DH5α and screened by restriction enzyme digest, gel electrophoresis and DNA sequence. Then the expression vectors were transfected into HEK293 cells, and its expression products were detected by Western Blot. The subcellular localization between endogenous ARRB1 and ARRB1-GFP in the SNB19 cells was detected and compared by using immunofluorescence staining. Results ARRB1-EGFP fusion protein eukaryotic expression vector was successfully constructed, and identified by Western Blot. Localization of the fusion protein, ARRB1-GFP, was similar with that of the endogenous ARRB1. Conclusion ARRB1-EGFP fusion protein can be safely and efficiently transfected into HEK293 cells and SNB19.

ARRB1; vector construction; expression; fusion proteins

R 34

A

2095-5227(2014)10-1059-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.10.023

時間：2014-06-06 11:07

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140606.1107.002.html

2014-04-02

文普帥，男，碩士，講師。Email: wenpushuai@gmail.com

高靜，女，碩士，主治醫(yī)師。Email: gaojinggg@163.com