張鳳香，孫大鵬，賀成業(yè)，韓冠英

遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州 121001

大蒜素增強腦膠質瘤細胞株U87對TRAIL敏感性的機制研究

張鳳香，孫大鵬，賀成業(yè)，韓冠英

遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州 121001

目的 研究大蒜素是否能通過增加腦膠質瘤細胞U87對腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)的敏感性來促進U87細胞的凋亡及其相關機制的研究。方法 采用MTT法檢測大蒜素聯合TRAIL對U87細胞活性的影響；流式細胞術(Annexin V/FITC)評估大蒜素聯合TRAIL對U87細胞凋亡的影響；Transwell實驗進一步檢測大蒜素聯合TRAIL對U87細胞的侵襲能力的影響；Western-blot、RT-PCR和Q-RT-PCR方法檢測大蒜素聯合TRAIL對與U87細胞凋亡相關的基因和蛋白的表達影響。結果 與其他組比較，大蒜素聯合TRAIL明顯降低U87細胞活力和侵襲能力，促進U87細胞凋亡。在分子水平上，與單獨作用組比較，聯合作用組明顯增加DR4、DR5、Caspase-3和Caspase-8的活性，而AKT、pFKHR、MMP-2和MMP-9的活性明顯被抑制。結論 大蒜素能增強腦膠質瘤細胞U87對TRAIL的敏感性，從而促進U87凋亡。

大蒜素；腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體；膠質瘤細胞系U87

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)是腫瘤壞死因子家族中的重要一員。研究表明，TRAIL可以通過與死亡受體DR4或DR5鏈接，激活Caspase-8促凋亡途徑，進而誘導腫瘤細胞凋亡[1]。但是某些腫瘤細胞對TRAIL的這種抗凋亡作用有抵抗性[2]。最近的研究表明，對TRAIL具有耐藥性的某些腫瘤細胞可以通過聯合化療作用增強其對TRAIL的敏感性，這表明聯合治療可能克服腫瘤細胞對TRAIL的耐藥性[3]。腦膠質瘤是人類腦部主要的一種腫瘤，大量研究表明，其癌癥細胞對TRAIL有很強的耐藥性[4-5]。因此，尋找一種能夠增強腦膠質瘤細胞對TRAIL敏感性的治療方法十分重要。大蒜素作為一種藥物已被廣泛使用，并對人體健康產生了積極的影響[6]。研究證明，大蒜及其制劑可以減少前列腺癌、結腸癌、喉癌和胃癌的發(fā)病率，對肝癌的治療作用也已經通過動物實驗得到了證實[7-8]。大蒜素還可以使乳腺癌細胞等腫瘤細胞對TRAIL的敏感性增強[9]。但大蒜素是否能增強腦膠質瘤細胞對TRAIL的敏感性尚不得而知。因此，本課題選取對TRAIL具有耐藥性的腦膠質瘤細胞U87作為研究對象，研究大蒜素是否能對TRAIL誘導的腦膠質瘤細胞凋亡產生影響。

材料和方法

1 材料 人腦膠質瘤細胞U87(中國科學院)；重組人可溶性TRAIL(Peprotech)；RPMI-1640，小牛血清(Hyclone)Leibovitz's L-15培養(yǎng)基(Gibco)；四甲基偶氮唑藍(dimethylthiazolyl-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(Sigma)；青霉素、鏈霉素(大連美羅)；Annexin V-FITC/PI試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)；兔抗人AKT，兔抗人pFKHR，鼠抗人Caspase-3、Caspase-8單克隆抗體，兔抗人MMP2、MMP9多克隆抗體均購自Abcam公司；山羊抗兔IgG，山羊抗鼠IgG購自中杉金橋；RTPCRkits和基因特異性引物(Takara)。

2 U87細胞的培養(yǎng)與傳代 人U87細胞用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的Leibovitz's L-15培養(yǎng)基，在5% CO2、37℃恒溫箱中培養(yǎng)。每2 ～ 3 d更換1次培養(yǎng)液，至第5天細胞達到合適密度，用0.25%胰蛋白酶消化1 min，置顯微鏡下觀察。當細胞將要分離而呈圓粒狀時，棄掉胰酶，加入適量的培養(yǎng)液，反復吹打貼壁細胞，將細胞懸液按1∶2稀釋，傳到新培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。

3 MTT檢測U87細胞的增殖 取對數生長期細胞，0.25%胰酶消化，調整細胞濃度為5×104/ml，按每孔200 μl接種于96孔板，按0 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml TRAIL或10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml、40 μg/ml、50 μg/ml Allicin添加，每組設4個平行孔，每孔反應體系總體積為200 μl，37℃、無CO2條件下培養(yǎng)，分別于24 h、48 h和72 h時，每孔加入新鮮配制的濃度為5 mg/ml MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DSMO，微量振蕩器上振蕩10 min，室溫孵育30 min后放入酶標儀，以490 nm波長檢測光密度值(OD)。

4 AnnexinⅤ-FITC/PI檢測U87細胞的凋亡 培養(yǎng)48 h后收集各組細胞，調整細胞濃度至1×106/ml，以冷PBS洗2次并用1×Binding Buffer重懸，每組分別取100 μl移至新管，加入5 μl FITC AnnexinⅤ及5 μl PI，振蕩后于室溫下避光靜置15 min，每管加入400 μl 1×Binding Buffer，染色后上流式細胞儀檢測。

5 Transwell檢測U87細胞的侵襲能力 將Matrigel與L-15培養(yǎng)基按1∶4稀釋，在Transwell上室中加入40 μl的Matrigel稀釋液，37℃孵育12 h，使膠凝固。各組細胞用含0.1% BSA的無血清培養(yǎng)基重新懸浮，調整細胞濃度至2×105/ml。取100 μl細胞加入上室，500 μl含10%血清培養(yǎng)基加入下室，每組設3個復孔，于CO2孵箱培養(yǎng)48 h后，取出小室，用棉簽蘸取PBS輕輕擦掉上膜細胞，小室以甲醇固定15 min，PBS洗滌3次，每次5 min；結晶紫染色15 min，PBS洗滌3次，每次5 min，后鏡下觀察，每個濾膜隨機取5個視野(100×)，取均值計數，照相分析。

6 RT-PCR和qRT-PCR檢測相關基因表達收集并計數各組細胞，按5×106個細胞加1 ml RNAiso Plus提取細胞總RNA，經紫外分光光度計檢測RNA濃度，參照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄反應。反轉錄PCR法檢測；DR4：forward 5' GGAACACAGCATGTCAGTGCAA 3'，reverse5' TGTCACTCCAGGGCGTACAATC 3'；DR5：forward 5' AGCTAAGTCCCTGCACCACGA 3'，reverse5' TGTACAATCACCGACCTTGACCA 3'；caspase3：forward 5' GACTCTGGAATATCCCTGGACAACA 3'，reverse 5'CTGAGGTTTGCTGCATCGACA 3'；caspase8： forward 5' CCAAATGCAAACTGGATGATG AC 3'， reverse 5' CTCTTGTTGATTTGGGCACAGAC 3'。MMP2： forward 5' AGCTAAGTCCCTGCACCACG A 3'，reverse 5' TGTACAATCACCGACCTTGACCA 3'；MMP9：forward 5' CAACAACCATGCTGGGCATC 3'，reverse 5' TGATGTCAGTCACTTGGGCATTAAC 3'；AKT：forward 5' TCCTGGTTGTCCTAGCTGTC 3'，reverse5' CAGGCTTTACAAGTGATGAG 3'；p-FHKR：forward 5' GAAGGTGAAGGTCGGAGTC 3'，reverse5' GAAGATGGTGATGGGATTTC 3'。擴增條件為：95℃ 30 s；94℃ 5 s，61℃ 30 s，共30個循環(huán)。

7 Western blot檢測相關蛋白表達 收集各組細胞，PBS洗2次，以裂解緩沖液提取細胞總蛋白。每孔40 μg的含量加樣，電泳分離。轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉在37℃封閉2 h。分別與1∶300兔抗人DR4、DR5；1∶2 000鼠抗人Caspase3、Caspase8；1∶600兔抗人MMP2、MMP9；1∶1 000兔抗人AKT和pFHKR等抗體4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG(1∶500)羊抗兔IgG(1∶500)，4℃孵育2 h。洗膜3次，每次10 min。ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，凝膠成像。

8 統(tǒng)計學方法 所有數據均用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，結果用±s表示，采用ANOVA分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 大蒜素可增強U87細胞對TRAIL的敏感性抑制細胞活性 在U87細胞中當TRAIL劑量≤50 ng/ml時，細胞活力為75.67%±4.93%。當TRAIL劑量增至200 ng/ml或延長至72 h時，細胞活力沒有降低(圖1A)。在U87細胞中，30 μg/ml大蒜素+ 50 ng/ml TRAIL細胞活力從71.21%±0.07%明顯降到29.02%±3.16%，而20 μg/ml大蒜素+ 50 ng/ml TRAIL不能進一步增加細胞毒性。提示30 μg/ml大蒜素+ 50 ng/ml TRAIL可降低U87細胞的生存能力(圖1C)。

2 大蒜素可增加U87細胞對TRAIL的敏感性誘導凋亡 在U87細胞加入50 ng/ml TRAIL和(或) 30 μg/ml大蒜素作用48 h后，流式細胞儀檢測顯示，大蒜素+ TRAIL組凋亡率為76.30%，大蒜素組為15.94%，TRAIL組為28.8%。與其他組比較，大蒜素+ TRAIL組明顯促進細胞凋亡。見圖2。

3 大蒜素可增加U87細胞對TRAIL的敏感性降低侵襲能力 培養(yǎng)48 h后，與其他組相比大蒜素+ TRAIL組，U87細胞的侵襲能力被顯著抑制。見圖3。

4 大蒜素和TRAIL對U87細胞內DR4和DR5表達的調控 TRAIL僅輕微誘導DR4和DR5的表達。大蒜素和TRAIL聯合作用明顯增強DR4和DR5的表達。見圖4。

5 大蒜素和TRAIL對U87細胞內Caspases家族表達的調控 大蒜素+ TRAIL組明顯增強Caspase-3、Caspase-8的表達。見圖5。

6 大蒜素和TRAIL對U87細胞內MMPs家族表達的調控 大蒜素+ TRAIL組明顯抑制MMP-2和MMP-9的表達。見圖6。

7 大蒜素和TRAIL對U87細胞內Akt和pFKHR表達的調控 大蒜素+TRAIL組能更有效地下調Akt和pFKHR表達。見圖7。

討 論

在該研究中，我們檢測大蒜素是否能增加U87對TRAIL的敏感性，從而進一步促進細胞的凋亡，并對其分子機制進行了研究。MTT和Annexin V/ FITC檢測結果表明，TRAIL和大蒜素聯合治療能夠明顯降低U87細胞活力并促進U87細胞凋亡。Transwell檢測結果表明，與其他組比較，大蒜素和TRAIL聯合作用組的U87細胞侵襲能力被明顯抑制。以上結果表明，大蒜素和TRAIL聯合治療可以明顯抑制U87細胞活力和侵襲能力，并促進細胞凋亡。

圖 1 大蒜素和(或)TRAIL對U87細胞活性的影響Fig. 1 Effects of allicin and/or TRAIL on U87 cells viability

圖 2 流式細胞術分析顯示作用48 h后TRAIL + Allicin組可明顯促進細胞凋亡Fig. 2 Flow cytometry analysis showed that TRAIL + Allicin group could significantly enhance apoptosis in cells after 48 h

圖 3 Transwell分析結果顯示作用48 h后TRAIL + Allicin組可明顯抑制細胞的侵襲Fig. 3 Transwell analysis showed that TRAIL + Allicin group could inhibit invasion of cells after 48 h A： control；B：allicin；

圖 4 TRAIL和(或) Allicin對DR4和DR5表達的影響 A：Western blot檢測DR4和DR5的蛋白表達情況； B：RT-PCR檢測DR4和DR5的mRNA表達情況； C：q-PCR檢測DR4 和DR5的表達情況Fig. 4 Effect of TRAIL and/or allicin on the expression of DR4 and DR5 A: Western blot analysis showing the protein expression of DR4 and DR5; B: Real-time-PCR analysis showing the mRNA expression of DR4 and DR5; C: Q-RTPCR analysis showing the expression of DR4 and DR5

圖 5 TRAIL和(或) Allicin對Caspase-3和Caspase-8表達的影響A：Western blot檢測Caspase-3和Caspase-8的蛋白表達情況； B：RT-PCR檢測Caspase-3和Caspase-8的mRNA表達情況；C：q-PCR檢測Caspase-3和Caspase-8的表達情況Fig. 5 Effect of TRAIL and/or allicin on the expression of caspase-3 and caspase-8 A: Western blot analysis showing the protein expression of caspase-3 and caspase-8; B: Real-time-PCR analysis showing the mRNA expression of caspase-3 and caspase-8; C: Q-RTPCR analysis showing the expression of caspase-3 and caspase-8

圖 6 TRAIL和(或) Allicin對MMP-2和MMP-9表達的影響A：Western blot檢測MMP-2和MMP-9的蛋白表達情況；B：RT-PCR檢測 MMP-2和MMP-9的mRNA表達情況；C：q-PCR檢測MMP-2和MMP-9的表達情況Fig. 6 Effect of TRAIL and/or allicin on the expression of MMP-2 and MMP-9 A: Western blot analysis showing the protein expression of MMP-2 and MMP-9; B: Real-time-PCR analysis showing the mRNA expression of MMP-2 and MMP-9; C: Q-RT-PCR analysis showing the expression of MMP-2 and MMP-9

圖 7 TRAIL和(或) Allicin對Akt和pFKHR表達的影響A：Western blot檢測Akt和pFKHR的蛋白表達情況； B：RTPCR檢測Akt和pFKHR的mRNA表達情況； C：q-PCR檢測Akt和pFKHR的表達情況Fig. 7 Effect of TRAIL and/or allicin on the expression of Akt and pFKHR A: Western blot analysis showing the protein expression of Akt and pFKHR; B: Real-time-PCR analysis showing the mRNA expression of Akt and pFKHR; C: Q-RTPCR analysis showing the expression of Akt and pFKHR

眾所周知，TRAIL是通過與DR4和DR5的相互作用來觸發(fā)凋亡信號，然后引起Caspase-8介導的細胞凋亡，而在該過程中DR4和DR5起到了核心作用。而TRAIL只有在表達DR4和DR5的腫瘤細胞中才能起到誘導細胞凋亡的作用。本研究表明，與其他組比較，大蒜素和TRAIL聯合治療明顯增強DR4和DR5的表達。該研究結果表明，上調DR4和DR5的表達可能在大蒜素增強U87細胞對TRAIL敏感性的過程中起到了重要作用。最近有研究報道，一些化療藥物可以通過激活Caspase-3的活性來使一些本來對TRAIL有耐藥性的腫瘤細胞恢復對TRAIL的敏感性。Caspase-3是凋亡蛋白酶家族的一員，是凋亡通路的重要組成部分。我們的研究結果發(fā)現，在TRAIL聯合大蒜素促進膠質瘤細胞凋亡的過程中，Caspases家族是引發(fā)細胞凋亡的關鍵調節(jié)點。

基質金屬蛋白酶幾乎能降解細胞外基質中的所有蛋白成分，在腫瘤侵襲轉移中起關鍵性作用[10-11]。本研究結果顯示，大蒜素和TRAIL聯合作用組比單獨作用組能更有效地抑制MMP-2和MMP-9的表達。該研究結果表明，大蒜素可通過提高TRAIL的活性降低MMP-2和MMP-9的表達，從而抑制U87細胞生長。

有研究發(fā)現，Akt是一些抗癌藥物的關鍵靶點[12]。而叉頭轉錄因子家族是作為Akt介導的細胞凋亡系統(tǒng)下游的一個靶點。在Akt促進細胞存活的機制中，活化的Akt可以通過磷酸化FKHR轉錄因子使其失活，從而抑制細胞凋亡。同時叉頭蛋白既是Akt下游靶點，又對Fas配體具有調節(jié)作用[13]。本研究證實，TRAIL和大蒜素聯合作用組可以通過降低Akt的表達和激活FKHR的活性來抑制PI3K/AKT信號通路的傳導，從而抑制U87細胞的生長。

總之，我們的研究結果表明，TRAIL和大蒜素聯合作用可以通過上調DR4、DR5和Caspases的表達，降低MMPs的表達，抑制PI3K/Akt信號通路，進而抑制腦膠質瘤細胞的活力和侵襲能力，促進細胞凋亡。因此，在腦膠質細胞瘤治療中，使用TRAIL和大蒜素聯合治療或許是一個可研究的方向。

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Allicin enhances antitumor activity of gliomas cells line U87 to TRAIL

ZHANG Feng-xiang, SUN Da-peng, HE Cheng-ye, HAN Guan-ying
The First Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning province, China

HAN Guan-ying. Email: canghaiguanri@126.com

Objective To explore whether allicin can increase the sensitivity of glioma cells to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)-mediated apoptosis and its mechanism. Methods The effect of allicin combined with TRAIL on cell viability and cell apoptosis of U87 was detected by MTT assay and Annexin V/FITC assay, respectively. The invasive potential of allicin combined with TRAIL to U87 cells was further detected by Transwell experiment, and Western-blot, RT-PCR and Q-RTPCR were used to detect the expression of genes and proteins in allicin combined with TRAIL. Results The synergistic treatment significantly reduced cells viability and invasive activity, while promoted apoptosis in the tested U87 cells. At the molecule level, the synergistic treatment significantly increased the activation of DR4, DR5, caspase-3 and caspase-8, while the expression of AKT, pFKHR, MMP-2 and MMP-9 was significantly inhibited. Conclusion It suggests that allicin can increase the sensitivity of U87 to TRAIL, thus enhancing the apoptosis of U87.

allicin; tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand; gliomas cells line U87

R 73-3

A

2095-5227(2014)10-1063-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.10.024

時間：2014-06-18 13:25

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140618.1325.002.html

2013-10-28

張鳳香，女，博士，主治醫(yī)師。Email: zhangfengxiang64 @163.com

韓冠英，男，副教授。Email: canghaiguanri@126.com