畢艷紅,王朝宇,2*,趙立,王曉莉,趙希榮,劉欣欣

天然蘋果籽殼色素的提取及穩(wěn)定性研究

畢艷紅1,王朝宇1,2*,趙立1,王曉莉1,趙希榮1,劉欣欣1

1.淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院,江蘇淮安223003
2.江蘇省生物質(zhì)轉(zhuǎn)化與過(guò)程集成工程實(shí)驗(yàn)室,江蘇淮安223005

本文以蘋果籽殼為原料，首次研究了天然蘋果籽殼色素的提取和光譜學(xué)特性，并考察了金屬離子、pH值、光照、溫度、氧化還原劑以及常用食品添加劑對(duì)其穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，蘋果籽殼色素易溶于堿性水溶液，不溶或者難溶于非極性溶劑。紫外-可見(jiàn)光譜分析表明，色素在264 nm處有吸收峰。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，色素易與二價(jià)或者三價(jià)金屬離子形成沉淀，在偏酸至中性范圍內(nèi)較穩(wěn)定，對(duì)光、熱、氧化劑、還原劑以及各種食品添加劑耐受性強(qiáng)。該色素有望開發(fā)成為安全可靠的天然植物色素添加劑。

蘋果籽殼;天然色素;紫外-可見(jiàn)光譜;穩(wěn)定性

食用色素分為人工合成色素和天然色素兩類[1]。人工合成色素具有色澤鮮艷、性質(zhì)穩(wěn)定、著色力強(qiáng)、堅(jiān)牢度大、調(diào)色容易、使用方便、成本低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)。但近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其毒害作用不僅表現(xiàn)為一般毒性和致瀉性，有些品種還具有致癌性[2,3]。天然色素是人們通過(guò)一定的技術(shù)手段從自然界的動(dòng)植物細(xì)胞組織中取得的色素。與合成色素相比，它們具有無(wú)毒、色彩自然的特點(diǎn)，逐漸成為當(dāng)今世界發(fā)展的新趨勢(shì)，其開發(fā)應(yīng)用也成為一大研究熱點(diǎn)[4,5]。

蘋果籽為薔薇科植物蘋果的種子。蘋果籽中含有25.3%的脂肪（不飽和脂肪酸占脂肪酸總量的89.33%）、34.0%的蛋白質(zhì)（其中必需氨基酸占總氨基酸含量的29%）、各種常量和微量元素。此外，還含有一些糖苷、生物堿以及鞣質(zhì)等物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)成分豐富[6,7]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)蘋果籽及蘋果籽特性的研究主要涉及蘋果籽油的提取和蘋果籽蛋白的開發(fā)，而作為占蘋果籽一定比重的蘋果籽殼色素的研究和應(yīng)用鮮有報(bào)道。且大量研究表明，天然色素除了用作食品、日用化學(xué)品和藥品等產(chǎn)品的著色劑外，大部分還具有防腐、抑菌、抗氧化、抗衰老及清除人體自由基的作用[8-10]。因此，對(duì)蘋果資源的綜合開發(fā)，尤其是對(duì)蘋果籽中色素的提取及特性的研究顯得尤為迫切，具有重要的理論研究和應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

紅富士蘋果籽，取蘋果籽殼于50℃烘干后磨粉備用。

NaOH、Na2CO3、NaHCO3、甲醇、無(wú)水乙醇、95%乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、濃鹽酸、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、ZnSO4、CuSO4、AlCl3、FeCl3、Pb(CH3COO)2、MnSO4等均為分析純；蔗糖、食鹽、檸檬酸、苯甲酸鈉、山梨酸鉀等均為食品級(jí)。

1.2主要儀器與設(shè)備

DHZ-C型搖床，江蘇太倉(cāng)市試驗(yàn)設(shè)備廠；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；LXJ-IIB型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；FA2004N型精密電子天平，上海青海儀器有限公司；UV-2401PC型紫外-可見(jiàn)分光光度儀，日本島津公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蘋果籽殼色素提取溶劑的選擇分別稱取0.10 g蘋果籽殼粉樣品，加入一定體積的不同溶劑，密封口后置于搖床中，在50℃條件下，60 r/min萃取24 h后觀察現(xiàn)象，確定最佳提取溶劑。

1.3.2 色素的粗提及純化稱取1.00 g蘋果籽殼粉置于50 mL的錐形瓶中，加入25 mL的最佳提取溶劑，在50℃條件下反復(fù)浸提至色素提取干凈。將上述色素提取液pH值調(diào)節(jié)至中性，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中于50℃條件下減壓濃縮，冷卻過(guò)濾即得濃縮液，然后用石油醚和乙酸乙酯分別對(duì)色素濃縮液進(jìn)行三次萃取以去除脂溶性雜質(zhì)。

參照文獻(xiàn)[11]中所述方法，選擇酸沉法對(duì)色素進(jìn)行純化。

1.3.3 蘋果籽殼色素的紫外-可見(jiàn)光譜測(cè)定配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的色素-水溶液，于UV-2401PC型

紫外-可見(jiàn)分光光度儀上，220～700 nm范圍內(nèi)掃描。

1.3.4 蘋果籽殼色素的穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.3.4.1 金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響配制質(zhì)量濃度0.01%的色素水溶液，分別加入不同的金屬離子溶液，充分搖勻，靜置10 h后觀察現(xiàn)象。

1.3.4.2 pH對(duì)色素穩(wěn)定性的影響配制質(zhì)量濃度0.01%色素溶液，分別用0.10 mol/L HCl和0.10 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值，在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，并觀察現(xiàn)象。

1.3.4.3 光照對(duì)色素穩(wěn)定性的影響配制質(zhì)量濃度0.01%色素溶液，分別放置于日光燈和紫外燈下照射一定時(shí)間，測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)處吸光度，并觀察現(xiàn)象。

1.3.4.4 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性的影響配制質(zhì)量濃度0.01%色素水溶液，分別于40、60、80和100℃條件下加熱一定時(shí)間，于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并觀察現(xiàn)象。

1.3.4.5 氧化劑和還原劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響在試管中分別加入0.01%色素溶液4 mL，然后分別加入10%過(guò)氧化氫100、200、300、400、500μL，用蒸餾水定容至5 mL，分別處理1 h和12 h，之后于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并觀察現(xiàn)象。另取試管，分別加入0.01%色素水溶液4 mL，然后每支試管分別加入1.0%亞硫酸氫鈉100、200、300、400、500μL，用蒸餾水定容至5 mL，分別處理1 h和12 h后，于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并觀察現(xiàn)象。

1.3.4.6 常用食品添加劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響在0.01%的色素溶液中分別添加蔗糖、食鹽、檸檬酸以及常用防腐劑苯甲酸鈉和山梨酸鉀，于最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度，并觀察現(xiàn)象。

2 結(jié)果與討論

2.1蘋果籽殼色素提取溶劑的選擇

蘋果籽殼色素在不同溶劑中的溶解特性如表1所示。色素可溶于極性較大的溶劑中，而不溶于或難溶于非極性溶劑中。30%乙醇、1.0%NaHCO3、1.0%Na2CO3、1.0%NaOH具有較強(qiáng)的提取能力，而95%乙醇、甲醇、蒸餾水及1.0%HCl有一定的提取能力，非極性及極性較小的溶劑如石油醚、乙酸乙酯、丙酮等不能提取色素，利用1.0%NaOH提取的色素，提取效率較高，因此在色素粗提中確定1.0%NaOH為提取劑。

表1 蘋果籽殼色素在不同溶劑中的溶解性Table 1 Solubility of the pigments from apple seed shells in different solvents

2.2蘋果籽殼色素的紫外光譜測(cè)定

用0.01%的色素-水溶液，于UV-2401PC型紫外-可見(jiàn)分光光度儀上，在220～700 nm范圍內(nèi)掃描，得其光譜圖（圖1），其最大吸收波長(zhǎng)為264 nm。

圖1 色素的紫外-可見(jiàn)吸收光譜Fig.1 UV-vis spectra of the pigment from apple seed shells

2.3蘋果籽殼色素的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.3.1 金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響添加不同的金屬離子對(duì)色素的影響如表2所示，Na+、K+、Mg2+對(duì)色素的穩(wěn)定性影響較小，而Ca2+、Zn2+、Cu2+、Al3+、Fe3+以及Pb2+均可使色素生成較多沉淀。因此，在食品加工中使用該色素時(shí)要盡量避免與以上幾種離子接觸，以免生成沉淀影響產(chǎn)品質(zhì)量。

表2 常見(jiàn)金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響Table 2 Effects of different metal ions on the pigment from apple seed shells

2.3.2 pH值對(duì)色素穩(wěn)定性的影響由圖2可看到，在酸性和中性條件下，色素的穩(wěn)定性良好；在堿性條件下，色素溶液的顏色隨著pH的增大而逐漸加深，其吸光度值也在增大，說(shuō)明該色素適用于偏酸性至中性介質(zhì)。

2.3.3 光照對(duì)色素穩(wěn)定性的影響光照對(duì)蘋果籽殼色素的穩(wěn)定性的影響如圖3所示。照射時(shí)間相同條件下，該色素水溶液在264 nm處吸光度均是日光燈照射的比紫外燈照射的大。經(jīng)日光燈和紫外燈分別照射不同時(shí)間后，色素水溶液在264 nm處的吸光度變化不大，且不同處理之間差異不顯著（P＞0.05）。總體看來(lái)，色素水溶液對(duì)光的耐受性較好，不同處理之間沒(méi)有明顯可見(jiàn)的顏色變化。

圖2 pH值對(duì)色素的影響Fig.2 Effects of pH on the pigment from apple seed shells

圖3 光照對(duì)蘋果籽殼色素穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of light on the stability of pigment from apple seed shells

2.3.4 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性的影響圖4描述了溫度對(duì)蘋果籽殼色素的穩(wěn)定性的影響，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，40℃條件下，色素的吸光度值差異不顯著（P＞0.05），說(shuō)明其在此條件下較穩(wěn)定；60℃和80℃條件下處理較短時(shí)間（1 h和2 h）后，色素的吸光度值差異不明顯（P＞0.05），但是較長(zhǎng)時(shí)間處理后（3 h以上），色素的吸光度值發(fā)生較大變化，差異顯著（P＜0.05）；100℃處理后，色素的吸光度值差異出現(xiàn)顯著變化（P＜0.05），說(shuō)明高溫長(zhǎng)時(shí)處理對(duì)色素的穩(wěn)定性有較大的影響。原因可能是高溫處理使色素分子結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆的變化，其機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究[13]。

圖4 溫度對(duì)蘋果籽殼色素穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effects of temperature on the stability of pigment from apple seed shells

2.5.2 氧化劑和還原劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響氧化劑H2O2對(duì)蘋果籽殼色素穩(wěn)定性的影響如圖5所示。隨著H2O2處理濃度的增加，蘋果籽色素在264 nm處吸光度不斷增加，處理1 h和12 h之間差異不顯著（P＞0.05）。圖6描述了還原劑NaHSO3對(duì)蘋果籽殼色素穩(wěn)定性的影響，隨著NaHSO3處理濃度的增加，蘋果籽色素在264 nm處吸光度沒(méi)有顯著變化，處理1 h和12 h之間差異不顯著（P＞0.05）。通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，H2O2和NaHSO3經(jīng)短時(shí)間（1 h）處理后，色素溶液顏色變化不顯著，經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間（12 h）處理后，隨著氧化還原劑濃度的增大，色素溶液的顏色在逐漸變淡。可能是色素分子與氧化、還原劑發(fā)生反應(yīng)，生成了新物質(zhì)[14]?？傮w看來(lái)，蘋果籽殼色素對(duì)氧化劑和還原劑具有較強(qiáng)的耐受能力。

圖5 H2O2對(duì)蘋果籽殼色素穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of H2O2on the stability of pigment from apple seed shells注:數(shù)值為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,每組取樣數(shù)為3Note:Values are means±standard deviation(n=3)

圖6 NaHSO3對(duì)蘋果籽殼色素穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects of NaHSO3on the stability of pigment from apple seed shells注:數(shù)值為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,每組取樣數(shù)為3Note:Values are means±standard deviation(n=3)

圖7 蔗糖對(duì)蘋果籽殼色素穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of sucrose on the stability of pigment from apple seed shells注:數(shù)值為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,每組取樣數(shù)為3Note:Values are means±standard deviation(n=3)

圖8 食鹽對(duì)蘋果籽殼色素穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effects of salt on the stability of pigment from apple seed shells注:數(shù)值為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,每組取樣數(shù)為3Note:Values are means±standard deviation(n=3)

2.5.3 常用甜味劑及咸味劑對(duì)蘋果籽殼色素的影響常用甜味劑蔗糖以及咸味劑食鹽對(duì)蘋果籽殼色素的影響如圖7、8所示。蔗糖和食鹽的加入對(duì)蘋果籽色素的穩(wěn)定性影響不大，添加蔗糖和食鹽隨其濃度的增大，加入對(duì)蘋果籽色素的顏色幾乎沒(méi)有影響。因此，蘋果籽色素在蔗糖和食鹽存在下，其穩(wěn)定性不變，可廣泛應(yīng)用于各類食品的生產(chǎn)。2.5.4檸檬酸及防腐劑對(duì)蘋果籽殼色素的影響食品加工過(guò)程中的常用酸味劑檸檬酸對(duì)蘋果籽殼色素的影響如圖9所示。在蘋果籽色素中加入檸檬酸后，其吸光度略有下降，但不顯著（P＞0.05），并且色素溶液的顏色沒(méi)有明顯變化，表明該色素對(duì)檸檬酸穩(wěn)定。當(dāng)在色素溶液中加入常用防腐劑如苯甲酸鈉及山梨酸鉀后發(fā)現(xiàn)（圖10），其吸光度基本維持不變，同樣說(shuō)明蘋果籽色素對(duì)山梨酸鉀和苯甲酸鈉比較穩(wěn)定。

圖9 檸檬酸對(duì)蘋果籽殼色素穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effects of citric acid on the stability of pigment from apple seed shells

圖10 常用防腐劑對(duì)蘋果籽殼色素穩(wěn)定性的影響Fig.10 Effects of commonly used preservatives on the stability of pigment from apple seed shells

3 結(jié)論

(1)蘋果籽殼色素易溶于堿性水溶液，不溶或者難溶于非極性溶劑。用1.0%的NaOH提取色素，石油醚和乙酸乙酯分別萃取3次后獲得粗提色素，粗提色素經(jīng)酸沉法進(jìn)行純化。

(2)紫外-可見(jiàn)光譜分析表明，色素在264 nm處有吸收峰。

(3)穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，色素易與二價(jià)或者三價(jià)金屬離子形成沉淀，在偏酸至中性范圍內(nèi)色素較穩(wěn)定，對(duì)光、熱、氧化劑、還原劑以及各種食品添加劑耐受性強(qiáng)。

[1]繆少霞,王鵬,徐淵金,等.植物源天然食用色素及其開發(fā)利用研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā),2012,33(7):211-216

[2]HALLAGAN J B,ALLEN D C,BORZELLECA J F.The safety and regulatory status of food,drug and cosmetics colour additives exempt from certification[J].Food and Chemical Toxicology,1995,33(6):515-528

[3]YAO Z Y,QI J H,WANG L H.Isolation,fractionation and characterization of melanin-like pigments from chestnut (Castanea mollissima)shells[J].Jounal of Food Science,2012,77(6):671-676

[4]BOOA H O,HWANG S J,BAE C S,et al.Extraction and characterization of some natural plant pigments[J]. Industrial Crops and Products,2012,40:129-135

[5]高彥祥,許正虹.食用天然色素安全性研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2005,26(S1):158-162

[6]于修燭.蘋果籽以及蘋果籽油特性分析[D].陜西楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2004:27-28

[7]康美玲.蘋果籽營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定[J].農(nóng)產(chǎn)品加工,2008(11):72-77

[8]YOU T T,ZHOU S K,WEN J L,et al.Chemical composition,properties,and antimicrobial activity of the water-soluble pigments from Castanea mollissima shells[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014, 62(8):1936-1944

[9]王靜,劉昭明,肖凱軍,等.天然食用色素的結(jié)構(gòu)與生理活性分析[J].食品工業(yè)科技,2007,28(12):208-212

[10]ESTUPIN AN D C,SCHWARTZS J,GARZóN G.A.Antioxidant activity,total phenolics content,anthocyanin,and color stability of isotonic model beverages colored with Andes berry(Rubus glaucus Benth)anthocyanin powder[J]. Journal of Food Science,2011,76(1):26-34

[11]李永祥,詹少華,樊洪泓,等.板栗殼色素化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的初步研究[J].食品科學(xué),2008,29(12):51-54

[12]邱峰.天然藥物化學(xué)[M].北京:清華大學(xué)出版社,2013

[13]李永祥,詹少華,蔡永萍.板栗殼色素的提取、純化及穩(wěn)定性[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2008,24(9):298-302

[14]楊秀芳,王改利,馬養(yǎng)民.花椒籽種皮黑色素理化性質(zhì)和抗氧化活性的研究[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2014,35(1):82-86

Studies on the Extraction of the Pigment fromApple Seed Shells and Its Stability

BI Yan-hong1,WANG Zhao-yu1,2*,ZHAO Li1,WANG Xiao-li1,ZHAO Xi-rong1,LIU Xin-xin1
1.School of Life Science and Chemical Engineering,Huaiyin Institute of Technology,Huai'an223003,China
2.Jiangsu Provincial Engineering Laboratory for Biomass Conversion and Process Integration,Huai'an223005,China

The extraction,spectroscopy characteristic of the pigment from apple seed shells were studied for the first time, and the effects of different factors(such as metal ions,pH,light,temperature,oxidants,reducing agents and food additives) on the stability of the pigment were also investigated.The results were as follows:The pigment was soluble in alkaline solution,insoluble or poorly soluble in nonpolar solvents.The UV-visible spectrum analysis revealed that there was an apparent absorption peak near 264 nm.The pigment solution was easily precipited when some divalent and trivalent metal ions were added.In addition,it was suitable for use in acidic and neutral conditions and could be relatively stable for light, temperature,oxidants,reducing agents and some kinds of food additives.Therefore,the pigment from apple seed shells was a kind of safe and reliable natural plant pigment.

Apple seed shells;natural pigment;UV-vis spectrum;stability

S38

A

1000-2324(2014)05-0641-05

2013-03-11

2013-04-09

江蘇省自然科學(xué)基金(BK2012243);江蘇省高校青藍(lán)工程優(yōu)秀青年骨干教師培養(yǎng)項(xiàng)目、淮陰工學(xué)院科研基金項(xiàng)目(HGC1311)

畢艷紅(1981-),女,講師,主要從事食品酶學(xué)、天然產(chǎn)物提取及構(gòu)效關(guān)系研究.

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:biowzy@126.com