王 瓊 李惠勉

2型糖尿病大鼠腦組織EGFL-7的表達(dá)及氨基胍和Baicalein對(duì)其干預(yù)作用

王 瓊 李惠勉△

目的 研究人表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域蛋白-7（EGFL-7）因子在2型糖尿病大鼠腦組織中的表達(dá)以及氨基胍、Baicalein干預(yù)后對(duì)其影響。方法48只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病組、氨基胍組、Baicalein組4組，每組12只。正常對(duì)照組給予普通飲食喂養(yǎng)；糖尿病組、氨基胍組、Baicalein組采用高脂高糖飲食聯(lián)合腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素的方法建立糖尿病大鼠模型。造模成功后，氨基胍組、Baicalein組分別給予氨基胍溶液、Baicalein溶液灌胃，劑量均為150 mg/（kg·d），正常對(duì)照組、糖尿病組給予等量生理鹽水灌胃。16周后，用免疫組織化學(xué)法及蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測(cè)各組大鼠腦組織EGFL-7的表達(dá)。結(jié)果免疫組織化學(xué)法及蛋白免疫印跡法均顯示，與正常對(duì)照組比較，糖尿病組、氨基胍組及Baicalein組EGFL-7的表達(dá)均明顯增加（P＜0.01），與糖尿病組比較，氨基胍組、Baicalein組EGFL7表達(dá)明顯降低（P＜0.01），Baicalein組與氨基胍組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論EGFL-7可能參與糖尿病大鼠腦血管增生與重塑，氨基胍、Baicalein在一定程度上抑制其血管增生，其抑制作用可能是通過(guò)降低EGFL-7表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

糖尿病,2型；人表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域蛋白-7；氨基胍；Baicalein；血管增生；血管重塑

人表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域蛋白-7（epidermal growth factor-like domain-7，EGFL-7）是最新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)皮細(xì)胞特異性分泌因子，在血管管腔形成中具有重要的作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)EGFL-7在斑馬魚(yú)[1]、鼠[2]及人[3]的胚胎及動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞高水平表達(dá)，而在糖尿病所引起的腦血管損傷中表達(dá)尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察該因子在腦血管中表達(dá)情況，并應(yīng)用氨基胍及Baicalein 2種藥物進(jìn)行干預(yù)，探討其對(duì)糖尿病大鼠腦組織的可能影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 8～9周齡SD大鼠48只，體質(zhì)量180～200 g（鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）和氨基胍（美國(guó)sigma公司），Baicalein（上?？笊锛夹g(shù)有限公司），One-Touch-Ⅱ型血糖儀及試紙（美國(guó)強(qiáng)生公司），兔抗人EGFL-7多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；免疫組化試劑盒、DAB試劑盒（北京中杉生物工程公司），Western二抗（Jackson ImmunoResearch公司），內(nèi)參β-actin一抗（美國(guó)GenView公司），ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（PIERCE）。

1.2 動(dòng)物模型的制備和分組 48只SD大鼠應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、糖尿病組、氨基胍組和Baicalein組，每組12只，正常對(duì)照組給予普通飲食喂養(yǎng)；其余3組按照文獻(xiàn)[4]的方法建立糖尿病大鼠模型，即先分別給予高脂高糖飲食（10.0％豬油、20.0％蔗糖、2.5％膽固醇、1％膽鹽、66.5％普通飼料）喂養(yǎng)，喂養(yǎng)6周后，糖尿病組、氨基胍組及Baicalein組大鼠禁食不禁水12 h，于左下腹部腹腔注射30 mg/kg STZ溶液（臨用前用0.1 mmol/L，pH 4.2的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液配制成2％的溶液，避光進(jìn)行，現(xiàn)配現(xiàn)用），正常對(duì)照組腹腔注射等體積的枸櫞酸鈉緩沖液，72 h后尾靜脈采血，用One-Touth血糖儀測(cè)定血糖，以隨機(jī)非空腹血糖＞16.7 mmol/L定為糖尿病模型，造模成功后，氨基胍組、Baicalein組分別給予氨基胍溶液、Baicalein溶液灌胃，劑量均為150 mg/（kg·d），正常對(duì)照組、糖尿病組給予等量生理鹽水灌胃。各組大鼠均飼養(yǎng)16周，檢測(cè)血糖、觀察病情。

1.3 免疫組化法檢測(cè)大鼠腦組織EGFL-7的表達(dá) 16周末，各組大鼠用10％水合氯醛（250 mg/kg）腹腔注射麻醉，開(kāi)胸，用穿刺針小心插入左心室，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，生理鹽水10 mL經(jīng)心臟快速灌注，直至流出液體變清，再灌注4％多聚甲醛約250 mL，直到大鼠全身僵硬為止，開(kāi)顱取出全腦，去掉腦干和小腦，4％多聚甲醛固定8 h，常規(guī)石蠟包埋切片，PBS沖洗3次，浸泡5 min/次，室溫滴加3％H2O220 min，PBS沖洗3次，5 min/次，SP試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，一抗（EGFL-7，1∶100）二甲苯聯(lián)苯胺（DAB）顯色，鏡下控制顯色時(shí)間，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。EGFL-7的陽(yáng)性計(jì)數(shù)表達(dá)采用在高倍鏡（×400）下隨機(jī)讀取10個(gè)不重復(fù)視野，對(duì)染成淺棕色至深棕色血管數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，取平均值。

1.4 蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測(cè)大鼠腦EGFL-7蛋白的表達(dá) 于16周末各組大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速取腦，生理鹽水沖洗，迅速置于液氮罐低溫保存。從液氮罐中取出全腦，置于勻漿器中，按照每100 mg組織加入1 000 μL裂解液（RIPA）于冰上勻漿，4℃離心10 min；輕輕吸取上清，移至新的離心管中，-80℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)蛋白定量調(diào)整蛋白上樣量，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠濃度12％，分離膠濃度5％，電壓分別為濃縮膠80 V、分離膠120 V，半干轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5％脫脂奶粉封閉液封閉1 h，加入EGFL-7一抗，4℃孵育過(guò)夜，濃度為1∶500，用TBST搖床洗膜3次，每次5 min；加二抗，濃度1∶4 000，室溫孵育2 h，同上洗滌，分別滴加內(nèi)參一抗、二抗，ECL顯色，X線(xiàn)片壓片沖洗，掃描膠片上的條帶，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參灰度值比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果 EGFL-7的陽(yáng)性表達(dá)為淺棕色至深棕色顆?；虺蕳l索狀，主要表達(dá)于血管內(nèi)皮上，見(jiàn)圖1。與正常對(duì)照組相比，糖尿病組、氨基胍組、Baicalein組EGFL-7表達(dá)明顯增加（P＜0.01）,與糖尿病組相比，氨基胍組、Baicalein組EGFL-7的表達(dá)明顯減少（P＜0.01）；氨基胍組與Baicalein組表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

Tab.1 Expressions of EGFL-7 and the gray value of EGFL-7 in brain tissue in four groups表1 各組大鼠腦組織EGFL-7表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及相對(duì)灰度值 （±s）

Tab.1 Expressions of EGFL-7 and the gray value of EGFL-7 in brain tissue in four groups表1 各組大鼠腦組織EGFL-7表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及相對(duì)灰度值 （±s）

＊＊P＜0.01；a與正常對(duì)照組比較，b與糖尿病組比較，P＜0.01

相對(duì)灰度值（％）25.03±2.44 57.39±4.21a36.38±2.57ab33.45±5.22ab110.758＊＊組別正常對(duì)照組糖尿病組氨基胍組Baicalein組F n 12 12 12 12陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)0.39±0.69 18.80±2.62a14.10±1.97ab13.80±2.10ab15.598＊＊

2.2 Western blotting結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，糖尿病組、氨基胍組、Baicalein組EGFL-7表達(dá)均明顯增多（P＜0.01），與糖尿病組比較，氨基胍組、Baicalein組EGFL-7表達(dá)明顯降低（P＜0.01），Baicalein組與氨基胍組比較，EGFL-7的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)圖2，表1。

3 討論

3.1 EGFL-7基因和蛋白結(jié)構(gòu) EGFL-7又被稱(chēng)為血管內(nèi)皮抑制素（VE-statin），是一個(gè)分子質(zhì)量為30 ku的蛋白，其在物種中的表達(dá)高度保守。EGFL-7轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)位于上游5.4 kb啟動(dòng)子片段，包含了2個(gè)保守位點(diǎn)組成，被稱(chēng)為Ets結(jié)合位點(diǎn)。在胚胎和成年組織的轉(zhuǎn)基因小鼠，Ets轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)是運(yùn)載EGFL-7使其表達(dá)在內(nèi)皮基因上的重要的結(jié)合位點(diǎn)[5]。EGFL-7啟動(dòng)子還包含1個(gè)GATA-2共識(shí)結(jié)合位點(diǎn)[6]，這兩種結(jié)合位點(diǎn)使得EGFL-7對(duì)血液和血管內(nèi)皮早期發(fā)育起到了重要作用。

3.2 EGFL-7與血管內(nèi)皮重塑 目前研究發(fā)現(xiàn)，EGFL-7在促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、發(fā)芽以及浸潤(rùn)方面有重要的作用，并且與血管外基質(zhì)的重塑相關(guān)[7]，如腫瘤血管的生成，炎癥組織及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊等[8-9]。而在正常成熟組織中表達(dá)較低，說(shuō)明EGFL-7表達(dá)的升高與血管生成有關(guān)。在De Mazière等[1]研究斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)中消除了EGFL-7因子后，血管面積大量減少。在Schmidt等[2]研究也同樣證實(shí)，敲除了EGFL-7的純合子小鼠顯示出異常狀態(tài)的血管結(jié)構(gòu)。Campagnolo等[3]研究表明，EGFL-7在損傷的動(dòng)脈及動(dòng)脈粥樣硬化的管腔內(nèi)皮大量表達(dá)。在分別用低氧和磷酸酶誘導(dǎo)的冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷中，EGFL-7可通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB及細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）的表達(dá)來(lái)刺激血管再生[10-11]。可見(jiàn)EGFL-7通過(guò)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，成為促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管重塑的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠腦組織中EGFL-7表達(dá)增多，表明大鼠腦組織存在內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血管再生系統(tǒng)激活，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，導(dǎo)致血管增生和血管重塑。但其相關(guān)的機(jī)制和作用仍需進(jìn)一步深入研究。

3.3 氨基胍及Baicalein對(duì)糖尿病大鼠腦血管內(nèi)皮的保護(hù)作用 本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)氨基胍及Baicalein能夠降低EGFL-7的表達(dá)，起到保護(hù)腦血管的作用。氨基胍是一種親質(zhì)子肼類(lèi)化合物，可阻止糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的生成，改善在高血糖狀態(tài)下AGEs在血管壁上的積聚，從而減少對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。但因?yàn)槠洳涣挤磻?yīng)較大，限制了臨床應(yīng)用。Baicalein又名黃芩素，是中藥黃芩提取的黃酮類(lèi)化合物，具有廣泛的抗炎、抗氧化、抗病毒等藥理作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氨基胍、Baicalein在一定程度上參與了抑制血管再生及重建，改善血管內(nèi)皮損傷的作用，因此相對(duì)于氨基胍的不良反應(yīng)，Baicalein有望應(yīng)用于糖尿病血管重塑的臨床治療。

Fig.1 Expressions of EGFL-7 in four groups（DAD staining,×400）圖1 各組大鼠腦組織EGFL-7的表達(dá)（DAB染色，×400）

Fig.2 Expressions of EGFL-7 in brain tissue measured by Western blotting assay in four groups圖2 Western blotting檢測(cè)大鼠腦組織EGFL-7蛋白表達(dá)的結(jié)果

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（2014-01-10收稿 2014-07-17修回）

（本文編輯 李鵬）

The Expression of EGFL-7 in Brain Tissue of Type 2 Diabetic Rats and the Adjusting Function of Amioguanidine and Baicalein

WANG Qiong,LI Huimian△
Department of The Cadre Ward,The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450000,China△

E-mail:lihuimian630308@163.com

ObjectiveTo investigate the expression of epidermal growth factor-like domain 7(EGFL-7)in brain tissue of diabetes mellitus(DM)rats,and the intervene effect of amioguanidine and baicalein thereof.MethodsForty-eight SD rats were randomly divided into following four groups:control group,diabetic group,aminoguanidine group and baicalein group(n=12 for each group).The control group

only pelleted food and water.Diabetic group,aminoguanidine group and baicalein group were given high fat and sugar diet in combination with small dose of intraperitoneal injection of streptozotocin to establish the diabetic model.And then aminoguanidine group and baicalein group were given aminoguanidine and baicalein 150 mg/(kg·d)through oral gavaging.Diabetic group and control group were given equivalent saline through oral gavaging.After 16-week treatment,the expression of EGFL-7 proteins in rat brain was detected by immunohistochemistry and Western blotting methods.ResultsResultsof immunohistochemistry and Western blotting assay showed that the expression of EGFL-7 was significantly increased in diabetic group,aminoguanidine group and baicalein group compared with that of control group(P＜0.01).When compared with diabetic group,the expression of EGFL-7 was significantly decreased in aminoguanidine group and baicalein group(P＜0.01).There was no significant difference in the EGFL-7 expression between aminoguanidine group and baicalein group(P＞0.05).ConclusionEGFL-7 may play an important role in cerebral vascular hyperplasia and remodeling of diabetic rats.Aminoguanidine and baicalein restrained cerebral vessel growth by reducing the expression of EGFL-7.

diabetes mellitus,type 2；EGFL-7；amioguanidine；Baicalein;vascular hyperplsia;vascular remodeling

R743

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.11.003

河南省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目（122102310603）

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院干部病房（郵編450000）△

E-mail：lihuimian630308@163.com