龔淑敏 李光明 吳志敏 董莉真 程 彬 張 斌 朱 澤△

基于慢病毒載體系統(tǒng)構建重組JSRV-NM假病毒

龔淑敏1李光明2吳志敏2董莉真2程 彬2張 斌2朱 澤2△

目的 采用慢病毒質粒結構重組JSRV-NM假病毒，克服JSRV-NM病毒只能通過綿羊支氣管穿刺接種擴增，不能通過體外細胞培養(yǎng)擴增的問題。方法采用慢病毒高效包裝系統(tǒng)pMD.G、pCMV-HIV△8.2和pHIV-eGFP，以JSRV-NM病毒的env包膜質粒pCMVJSRV-NM替代VSV-G病毒的包膜質粒pMD.G，轉染293T細胞，復制、包裝并產出重組的JSRV-NM假病毒。用real-time PCR檢測WPRE表達來測定假病毒的滴度，用接種24孔板的293T細胞檢測假病毒感染力。結果成功重組了基于慢病毒質粒結構的JSRV-NM假病毒，可超速離心濃縮成高滴度（1×108TU/mL）的病毒，Lv-JSRV-NM包膜與Lv-VSV-G包膜按感染復數(shù)（MOI）=3的比例感染Hela細胞具有相同的感染能力。結論基于慢病毒質粒構建的JSRV-NM假病毒，能夠在293T細胞中復制和擴增，產出的假病毒具有穩(wěn)定性、感染力和安全性，符合二級生物實驗室安全的要求。

JSRV-NM病毒；假病毒；慢病毒載體；env基因；病毒包裝

加亞嘉西科逆轉錄病毒（Jaagsiekte retrovirus，JSRV）屬于RNA逆轉錄病毒，經呼吸道傳播，主要引起羊肺腺瘤（sheep pulmonary adenomatosis，SPA）。JSRV最早于1976年由英國愛丁堡大學的Sharp教授發(fā)現(xiàn)并分離鑒定，其包膜env基因是原癌基因，具有肺腺癌致瘤性[1-2]，前期有研究分離純化了我國內蒙古肺腺瘤綿羊中存在的JSRV[3]，并命名為加亞嘉西科逆轉錄病毒內蒙古病毒株（JSRV-NM）[4]。JSRV-NM基因組RNA為線性+ssRNA，全長7 642 bp，其基因組RNA編碼區(qū)內具有相互重疊的gag、pro、pol、env基因的典型結構[5]。慢病毒載體系統(tǒng)是以人類免疫缺陷病毒（HIV）-1為骨架，由3個編碼病毒顆粒gag、pol、env結構的包裝質粒pMD.G、pCMVHIV△8.2和pHIV-eGFP組成。包膜質粒pMD.G基因表達水皰性口炎病毒的包膜糖蛋白VSV-G[6]；包裝質粒pCMV-HIV△8.2用于表達病毒的結構蛋白以及病毒復制所需的酶等[7]。由于JSRV-NM病毒不能通過常規(guī)培養(yǎng)方法在體外復制和擴增，本研究在慢病毒載體系統(tǒng)基礎上，構建以JSRV-NM病毒env基因為包膜質粒，替代包膜VSV-G的質粒pMD.G，重組構建“JSRV-NM假病毒”，報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑和細胞 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自HyClone公司；HEPES、D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸購自Sigma公司；SOB培養(yǎng)液、Lipofectamine 2000和Trizol購自Invitrogen公司；real-time PCR和RT-PCR試劑盒購自TAKARA公司；質粒去內毒素大提試劑盒購自QIAGEN公司。其他試劑均為常用國產分析純級化學試劑。質粒轉化宿主菌為DH5α菌株。

1.2 細胞培養(yǎng) 人胚腎細胞系293T細胞、Hela細胞用含10％胎牛血清和100 g/L鏈霉素及100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。其培養(yǎng)均在37℃、5％CO2條件下進行。

1.3 慢病毒質粒系統(tǒng) 慢病毒載體系統(tǒng)由pMD.G、pCMVHIV△8.2和pHIV-eGFP質粒組成(法國國家醫(yī)學與健康研究院楊光華博士惠贈)。JSRV的env包膜質粒pCMV3JS21GP（英國格拉斯哥大學比較醫(yī)學研究院Massimo Palmarini教授惠贈）。JSRV-NM的env包膜質粒pCMVJSRV-NM由本實驗室構建。主要是JSRV-NM的env序列由PCR法擴增，插入pCI-neo載體，其啟動子為人巨細胞病毒（CMV）。

1.4 質粒的純化 將pHIV-eGFP、pCMV-HIV△8.2、pMD.G、pCMV3JS21GP、pCMVJSRV-NM等質粒分別轉化到高效感受態(tài)DH5α細胞中，涂板后37℃培養(yǎng)12～16 h。挑單個菌落于含3～5 mL SOB培養(yǎng)液的試管中震蕩培養(yǎng)8 h，然后取200μL菌液于含200 mLSOB培養(yǎng)液的錐形瓶中震蕩培養(yǎng)12～16 h，待光密度（OD）600值達到0.6～1.0時，按照QIAGEN去內毒素試劑盒步驟純化質粒。

1.5 慢病毒載體的包裝 用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細胞，以密度0.5×106/mL接種于直徑為15 cm的細胞培養(yǎng)皿，37℃，5％CO2培養(yǎng)，待密度達60％～70％時轉染，轉染前1 d將細胞培養(yǎng)液更換為不含抗生素的培養(yǎng)液。包裝DNA溶液分別為JSRV-NM包膜質粒pCMVJSRV-NM（12μg），JSRV-21包膜質粒pCMV3JS21GP（10μg），VSV-G包膜質粒pMD.G（7μg），質粒pCMV-HIV△8.2（8μg），pHIV-eGFP（10 μg）。將DNA溶液與轉染試劑Lipofectamine 2000混合并轉染293T細胞，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后倒去含有轉染混合物的培養(yǎng)液，加PBS液漂洗，然后加入含10％血清的細胞培養(yǎng)液15 mL，培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集293T細胞上清液。4℃，4 000×g離心10 min，以0.45 μm濾器過濾后置于40 mL超速離心管中；4℃，25 000 r/min離心20 min；而后以冰PBS液重懸病毒沉淀，于4℃溶解過夜即得到病毒液Lv-JSRV-NM、Lv-JSRV-21。同法獲得陽性對照和陰性對照病毒液Lv-VSV-G、Lv-Negative。以每管10 μL分裝病毒液置于-80℃冰箱中保存。

1.6 real-time PCR測定病毒滴度 用real-time PCR檢測整合到Hela細胞基因組中的慢病毒WPRE序列來測定成功感染進細胞的病毒滴度(單位TU/mL)，重復3次。接種Hela細胞于24孔板，每孔5×104個細胞，培養(yǎng)24 h后，將稀釋病毒液感染Hela細胞，12 h后換液。感染72 h后，提取Hela細胞基因組DNA，PCR引物為：正義5′-CCGTTTCAGGCAACGTG-3′；反義5′-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3′；探針FAMTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTAMRA。real-time PCR反應條件：50℃2 min；95℃15 min；95℃15 s，60℃1 min，40個循環(huán)。按以下公式計算：病毒滴度＝5×104（Hela細胞數(shù)）×每個細胞的WPRE序列拷貝數(shù)/孔中加入病毒原液的體積(mL)，具體方法見文獻[8]。

1.7 重組JSRV-NM慢病毒的感染力檢測 將上述1.6測定濃度的Lv-JSRV-NM及Lv-VSV-G分別按感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=3的比例感染Hela細胞，48 h后收集細胞進行real-time PCR檢測整合到Hela細胞基因組中的慢病毒WPRE序列，比較兩種包膜感染力。Hela細胞以濃度2× 105個/mL接種于24孔板中，每孔加500μL含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃，5％CO2培養(yǎng)過夜。吸去原培養(yǎng)液，加504μL含2％胎牛血清和病毒（4μL病毒液，MOI=3）的DMEM培養(yǎng)液，37℃，5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)過夜后，吸掉該培養(yǎng)液，再加500μL含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后，行real-time PCR檢測基因表達情況，方法詳見文獻[8]。

2 結果

2.1 高質量去內毒素質粒純化 采用QIAGEN無內毒素質粒純化試劑盒，獲得高質量的質粒pHIV-eGFP(450 mg/L)、pCMV-HIV△8.2(400 mg/L)、pMD.G (400mg/L)、pCMVJSRV-NM（350mg/L）、pCMV3JS21GP （380mg/L）。

2.2 假病毒的包裝 轉染293T細胞24 h后，在熒光顯微鏡下觀察到293T細胞中表達綠色熒光，證實了eGFP基因的表達。轉染48 h后，細胞中熒光強度較轉染24 h時有所增強，由此慢病毒載體由293T細胞包裝產生。包裝的假病毒中含有報告基因eGFP，成功重組包裝的病毒可以看到綠色熒光，見圖1、2。外層用JSRV-NM病毒包膜代替了VSV病毒的包膜。

2.3 假病毒的滴度測定 Lv-JSRV-NM的滴度為1.0×108TU/mL，Lv-VSV-G為1.2×108TU/mL，Lv-JS-RV-21為1.5×108TU/mL、Lv-Negative為1.6×108TU/mL。

2.4 感染力 Lv-JSRV-NM的感染率為86.7％，Lv-VSV-G為82.9％。

Fig.1 The green fluorescence are Lv-VSV-G(×200)圖1 綠色熒光為Lv-VSV-G(×200)

Fig.2 The green fluorescence are Lv-JSRV-NM(×200)圖2 綠色熒光為Lv-JSRV-NM(×200)

3 討論

本研究在以往研究JSRV-NM病毒[5]和構建慢病毒的基礎上[8]，構建了以JSRV-NM病毒的env包膜質粒替代VSV病毒的糖蛋白G包膜質粒，通過熒光檢測成功重組了新的基于慢病毒質粒結構的“JSRV-NM假病毒”。real-time PCR檢測顯示Lv-JSRV-NM包膜與Lv-VSV-G包膜具有一樣的功能及相同的感染能力。這不僅解決了JSRV-NM病毒不能在體外細胞復制和擴增的問題，且能更好地解決控制病毒的擴增數(shù)量、感染力和安全性問題，為進一步深入研究奠定了基礎。

采用基于慢病毒質粒結構重組的JSRV-NM假病毒具有更高的安全性，主要是因為筆者采用的慢病毒載體是一個將載體3′端長末端重復序列中的U3區(qū)增強子和啟動子序列去除的自身失活（self-inactivating，SIN）的載體[9]，這種結構組成能大大降低假病毒感染細胞后產生可復制的子代病毒的可能性。故JSRV-NM假病毒只具有一次感染能力，感染細胞模型后就不具有復制子代病毒的能力，同樣也沒有發(fā)現(xiàn)有基因突變和擴增出子代病毒及缺陷病毒等，故稱之為“假病毒”，具有很高的安全性，符合二級生物實驗室安全的要求。JSRV-NM包膜賦予重組JSRV-NM假病毒顆粒高度的穩(wěn)定性，JSRV-NM 的env包膜與VSV-G包膜一樣使病毒顆粒的穩(wěn)定性增加，能夠通過超速離心被濃縮成高滴度病毒，達到1×108TU/mL的高滴度。筆者也與Massimo Palmarini教授的JSRV21病毒包膜進行了比較[10]，發(fā)現(xiàn)JSRV-NM假病毒與其一樣有很好的感染能力。近來研究發(fā)現(xiàn)JSRV假病毒包膜侵入宿主細胞時是pH依賴型進行細胞膜融合[11]，為進一步研究提供很好的方向。

綜上，基于慢病毒質粒結構的高效包裝系統(tǒng)，本研究成功構建了JSRV-NM假病毒，具有更高的安全性、穩(wěn)定性、感染能力，解決了JSRV-NM的體外復制和擴增問題，為今后進一步深入研究JSRV-NM的env包膜引起的跨種屬感染，及env包膜致瘤性引起的肺腺癌的機制奠定了基礎。

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（2014-01-10收稿 2014-03-20修回）

（本文編輯 閆娟）

Construction of JSRV-NM Pseudovirions by High Efficiency Packaging System of the Lentivirus

GONG Shumin1，LI Guangming2，WU Zhimin2，DONG Lizhen2，CHENG Bin2，ZHANG Bin2，ZHU Ze2
1 The Fourth Hospital of Tianjin,Tianjin 300222,China;2 Department of Medical Microbiology,Tianjin Medical University ZHU Ze,E-mail:zhuze_2006@126.com

ObjectiveTo overcome the fact that SRV-NM virus can only multiple and amplify through partially purified jaagsiekte retrovirus inoculated intratracheally in sheep but it cannot be augmented using in vitro cell culture,we constructed JSRV-NM pseudovirions based on high efficiency packing system of lentivirus.MethodsLentivirus of three high efficiency packing plasmids system pMD.G,pCMV-HIV 8.2 and pHIV-eGFP was developed,and JSRV-NM-env coated plasmid pCMVJSRV-NM was used to substitute VSV-G virus coated plasmid pMD.G then co-transfected into 293T cells to replicate,package and produce restructured JSRV-NM pseudovirions.Gene expression of pseudovirion was determined through WPRE using real time PCR;Virus infectivity was detected through inoculating JSRV-NM pseudovirions into 24 pore plates.ResultsWe construct JSRV-NM pseudovirions successfully based on the lentivirus system.JSRV-NM pseudovirions can also be concentrated to higher titer(108TU/mL detected by real time PCR by ultracentrifugation without significant loss of activity.JSRV-NM and VSV-G pseudovirions infected on Hela cells(both MOI=3)respectively and no obvious difference were shown on their infection efficiency detected by real time PCR.ConclusionBased on lentivirus system, JSRV-NM pseudovirions can be multipled and amplified in 293T cell culture in vitro.JSRV-NM pseudovirions is stable without loss its infection activity and the requirements of biological laboratory safety II was also met.JSRV-NM pseudovirions will provide a useful tool for further study of JSRV-NM–env infection across species or its induction of lung adenocarcinoma.

JSRV-NM viruses；pseudovirions；lentivirus vector；env gene；virus packageing

Q939.47

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.004

國家自然科學基金資助項目(30772483)，天津市自然科學基金重點項目(08JCZDJC23400)

1天津市第四醫(yī)院（郵編300222）;2天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病原生物學教研室

△通訊作者 E-mail:zhuze_2006@126.com