王曉天 劉曉梅 湯仁仙 尤紅娟 李小翠 秦蘇萍 宋遠見

JNK磷酸化14-3-3在大鼠缺血性腦損傷中的作用

王曉天 劉曉梅 湯仁仙 尤紅娟 李小翠 秦蘇萍 宋遠見

目的探討c-Jun氨基末端激酶（JNK）磷酸化14-3-3在大鼠缺血性腦損傷中的作用。方法20只大鼠均分為4組：假手術(shù)組、缺血復灌組、SP600125組和溶劑對照組。制作大鼠全腦缺血模型，應用免疫沉淀和免疫印跡法檢測4組大鼠腦缺血復灌12 h海馬CA1區(qū)神經(jīng)元14-3-3磷酸化（p-14-3-3）、14-3-3與Bax結(jié)合、Bax在胞漿和線粒體的蛋白表達情況。結(jié)果與假手術(shù)組相比，缺血復灌組、溶劑對照組及SP600125組胞漿中的p-14-3-3蛋白、線粒體中的Bax蛋白均增高，14-3-3與Bax的結(jié)合降低，SP600125組的胞漿p-14-3-3蛋白、線粒體Bax蛋白低于缺血復灌組和溶劑對照組，14-3-3與Bax的結(jié)合高于缺血復灌組和溶劑對照組（均P＜0.05）。結(jié)論JNK磷酸化14-3-3在大鼠缺血性腦損傷中發(fā)揮了重要作用。

14-3-3蛋白質(zhì)類；JNK絲裂原活化蛋白激酶類；bcl-2相關(guān)X蛋白質(zhì)；腦缺血

14-3-3是一種錨合蛋白，以二聚體的形式廣泛存在于胞漿中，通過募集胞漿內(nèi)的凋亡蛋白如Bax、Bad、Ask1等，行使其抗凋亡的功能[1-3]。Park等[1]報道c-Jun氨基末端激酶（JNK）可磷酸化14-3-3蛋白，干擾Bax與14-3-3的結(jié)合，使Bax從14-3-3錨合蛋白上解離，轉(zhuǎn)位到線粒體，促進線粒體內(nèi)促凋亡因子的釋放，誘導細胞凋亡。本實驗制作大鼠四動脈結(jié)扎全腦缺血模型，通過注射JNK抑制劑SP600125，觀察其對缺血海馬CA1區(qū)神經(jīng)元中14-3-3磷酸化及Bax線粒體轉(zhuǎn)位的影響，探討JNK介導的14-3-3磷酸化在大鼠缺血性腦損傷中的重要作用，以期為缺血性腦血管疾病的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料正常健康SD大鼠20只，體質(zhì)量250～300 g，購自徐州醫(yī)學院實驗動物中心。14-3-3、p-14-3-3(Ser-58)抗體（Santa Cruz Biotechnology公司），Bax抗體（Cell Signaling Biotechnology公司），SP600125（Biomol公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及分組大鼠均分為4組：假手術(shù)組、缺血復灌組、SP600125組和溶劑對照組。采用四動脈結(jié)扎法制作全腦缺血模型[4]，將大鼠麻醉后，分離其雙側(cè)頸總動脈并電凝椎動脈，次日于清醒狀態(tài)下結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，全腦缺血15 min，再灌注12 h處死，為缺血復灌組。假手術(shù)組的處理同缺血復灌組，但不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈。SP600125組將3 g/L的SP600125溶于1％二甲基亞砜（DMSO），于缺血前20 min腦室注射，10μL/只，10 min內(nèi)注射完[5]。溶劑對照組于缺血前20 min腦室注射等體積1％DMSO。

1.2.2 免疫印跡法檢測蛋白表達水平在4℃提取線粒體樣本：大鼠缺血復灌12 h，斷頭快速取腦，分離海馬CA1區(qū)，立即勻漿，1 000×g離心15 min，取上清，17 000×g離心20 min，沉淀為粗制線粒體部分，上清為與線粒體部分相對應的胞漿部分，BCA法測蛋白濃度后分裝。取等量變性蛋白質(zhì)樣本（胞漿部分和線粒體部分），經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，封閉，一抗4℃過夜，二抗室溫孵育2 h，顯色，測磷酸化14-3-3蛋白（p-14-3-3）、14-3-3和Bax蛋白表達情況。掃描膜上顯色條帶，并用Image J軟件分析，蛋白表達相對值以各組蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值來表示。

1.2.3 免疫沉淀法檢測蛋白相互結(jié)合情況取等量胞漿部分蛋白質(zhì)樣品，加入5倍體積IP緩沖液，以25 μL蛋白A/G-瓊脂糖預吸附1 h，10 000×g離心2 min，取上清，加入1～2 μg Bax抗體，旋轉(zhuǎn)混勻過夜，再加入25 μL蛋白A/G-瓊脂糖，旋轉(zhuǎn)混勻2 h，10 000×g離心2 min，沉淀用IP緩沖液洗3遍，加蛋白上樣緩沖液，混勻后置沸水浴中5 min，10 000×g離心2 min，吸上清，用14-3-3抗體行免疫印跡分析，以Bax/14-3-3表示胞漿中Bax與14-3-3蛋白結(jié)合情況。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，兩組樣本均數(shù)比較用t檢驗，多樣本均數(shù)比較用單因素方差分析，組間多重比較采用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 4組胞漿中p-14-3-3及14-3-3蛋白水平比較與假手術(shù)組相比，其他3組的p-14-3-3水平明顯增高，SP600125組的p-14-3-3水平低于缺血復灌組和溶劑對照組（均P＜0.05）；而溶劑對照組與缺血復灌組無明顯差異，見圖1、2。4組14-3-3蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（F=0.147，P＞0.05），見圖2。

Fig.1 Comparison of p-14-3-3 protein expression level between four groups圖1 4組p-14-3-3蛋白表達水平比較

Fig.2 The protein expressions of p-14-3-3 and 14-3-3 were detected by immunoblotting in four groups圖2 免疫印跡法檢測4組p-14-3-3和14-3-3蛋白表達

2.2 4組Bax與14-3-3蛋白結(jié)合情況比較與假手術(shù)組相比，其他3組胞漿中Bax與14-3-3蛋白結(jié)合顯著減少，SP600125組胞漿中Bax與14-3-3的結(jié)合高于缺血復灌組和溶劑對照組（均P＜0.05）；而溶劑對照組與缺血復灌組差異無統(tǒng)計學意義，見圖3、 4。4組Bax蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（F= 0.291，P＞0.05），見圖4。

Fig.3 Comparison of the binding of Bax and 14-3-3 between four groups圖3 4組Bax與14-3-3蛋白結(jié)合情況比較

Fig.4 The binding of Bax and 14-3-3 and the expression of Bax protein were detected by immunoprecipitation and immunoblotting in four groups圖4 免疫沉淀和免疫印跡法檢測4組Bax與14-3-3蛋白結(jié)合、Bax蛋白表達

2.3 4組線粒體中Bax蛋白表達水平比較與假手術(shù)組相比，其他3組線粒體組分中Bax蛋白表達水平明顯增高，SP600125組線粒體組分中Bax蛋白表達水平低于缺血復灌組和溶劑對照組（均P＜0.05）；而溶劑對照組與缺血復灌組相比差異無統(tǒng)計學意義，見圖5、6。

3 討論

JNK是絲裂原活化的蛋白激酶家族的成員，可被紫外線照射、炎性因子、生長因子撤除等多種凋亡刺激所激活[6-8]。JNK信號通路在腦缺血再灌注誘導的神經(jīng)元凋亡中發(fā)揮了重要作用。短暫腦缺血后JNK即被激活，激活的JNK順次磷酸化其核底物如c-Jun和胞漿底物如Bcl-2、Bad等，誘導神經(jīng)元凋亡。有文獻報道JNK可磷酸化另一胞漿底物14-3-3蛋白，促進細胞凋亡[9]。為此，本研究選擇了JNK抑制劑SP600125作為工具藥，以檢測腦缺血復灌過程中JNK能否磷酸化14-3-3，結(jié)果顯示SP600125可顯著抑制14-3-3的磷酸化，提示在腦缺血復灌過程中JNK可以使14-3-3磷酸化。

Fig.5 Comparison of Bax protein expression level in mitochondria between four groups圖5 4組線粒體中Bax蛋白表達水平比較

Fig.6 The expression of Bax protein in mitochondria was detected by immunoblotting in four groups圖6 免疫印跡法檢測4組線粒體中Bax蛋白表達

14-3-3是一種錨合蛋白，以二聚體的形式廣泛存在于胞漿中，它通過募集胞漿內(nèi)的凋亡蛋白如Bax、Bad等，而將其錨定在胞漿中，抑制其促凋亡活性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白可通過與Bad結(jié)合，阻止Bad轉(zhuǎn)位到線粒體，從而抑制神經(jīng)元凋亡[10]。本文主要研究了14-3-3蛋白募集胞漿內(nèi)的另一凋亡蛋白Bax，抑制Bax轉(zhuǎn)位至線粒體，行使其抗凋亡的功能，結(jié)果顯示SP600125可使胞漿中Bax與14-3-3的結(jié)合顯著增加，線粒體組分中Bax蛋白明顯減少，提示JNK磷酸化14-3-3蛋白，使Bax從錨合蛋白14-3-3上釋放，促進Bax轉(zhuǎn)位到線粒體，誘導細胞凋亡。Bax從14-3-3蛋白上釋放，可能是由于14-3-3磷酸化修飾后從空間構(gòu)型上干擾了其與Bax的結(jié)合。Bax轉(zhuǎn)位到線粒體外膜上，以同源二聚體的形式參與離子通道的形成，導致細胞色素c的釋放；也可能是通過開放其他的通道使細胞色素c釋放至胞漿[11]。

綜上，本實驗證實了腦缺血復灌過程中JNK可以使14-3-3磷酸化，也提示了14-3-3磷酸化后，干擾了其與Bax的結(jié)合，Bax與14-3-3分離，轉(zhuǎn)位到線粒體外膜，誘導神經(jīng)元凋亡。因此，JNK磷酸化14-3-3在大鼠腦缺血復灌過程中發(fā)揮了重要作用，為臨床防治人類缺血性腦卒中提供了新的思路。

[1]Park JK,Kang MY,Kim YH,et al.PKC delta in preeclamptic placentas promotes Bax dissociation from 14-3-3 zeta through 14-3-3 zeta phosphorylation[J].Placenta,2008,29(7):584-592.

[2]Fan J,Zhang N,Yin G,et al.Edaravone protects cortical neurons from apoptosis by inhibiting the translocation of BAX and Increasing the interaction between 14-3-3 and p-BAD[J].Int J Neurosci, 2012,122(11):665-674.

[3]Puckett MC,Goldman EH,Cockrell LM,et al.Integration of apoptosis signal-regulating kinase 1-mediated stress signaling with the Akt/protein kinase B-IκB kinase cascade[J].Mol Cell Biol,2013, 33(11):2252-2259.

[4]Pulsinelli WA,Brierley JB.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat[J].Stroke,1979,10(3):267-272. [5]Guan QH,Pei DS,Liu XM,et al.Neuroprotection against ischemic brain injury by SP600125 via suppressing the extrinsic and intrinsic pathways of apoptosis[J].Brain Res,2006,1092(1):36-46.

[6]Zhang J,Bowden GT.Activation of p38 MAP kinase and JNK pathways by UVA irradiation[J].Photochem Photobiol Sci,2012,11(1): 54-61.

[7]Kristiansen M,Menghi F,Hughes R,et al.Global analysis of gene expression in NGF-deprived sympathetic neurons identifies molecular pathways associated with cell death[J].BMC Genomics,2011, 12:551.

[8]Lisanti MP,Tsirigos A,Pavlides S,et al.JNK1 stress signaling is hyper-activated in high breast density and the tumor stroma:Connecting fibrosis,inflammation,and stemness for cancer prevention [J].Cell Cycle,2014,13(4):580-599.

[9]Kim YS,Jung MH,Choi MY,et al.Glutamine attenuates tubular cell apoptosis in acute kidney injury via inhibition of the c-Jun N-terminal kinase phosphorylation of 14-3-3[J].Crit Care Med,2009, 37(6):2033-2044.

[10]Wang XT,Pei DS,Xu J,et al.Opposing effects of Bad phosphorylation at two distinct sites by Akt1 and JNK1/2 on ischemic brain injury[J].Cell Signal,2007,19(9):1844-1856.

[11]Kuwana T,Mackey MR,Perkins G,et al.Bid,Bax,and lipids cooperate to form supramolecular openings in the outer mitochondrial membrane[J].Cell,2002,111(3):331-342.

（2014-02-25收稿2014-04-05修回）

（本文編輯閆娟）

The Effects of 14-3-3 Phosphorylation Induced by JNK on Ischemic Brain Injury in Rats

WANG Xiaotian,LIU Xiaomei,TANG Renxian,YOU Hongjuan,LI Xiaocui,QIN Suping,SONG Yuanjian Department of Pathogenic Biology and Immunology,Xuzhou Medical College,Xuzhou 221002,China

ObjectiveTo investigate the effects of 14-3-3 phosphorylation(p-14-3-3)induced by C-Jun N-terminal kinase(JNK)on ischemic brain injury in rats.MethodsTwenty rats were divided into 4 groups:sham operation group, ischemia-reperfusion group,SP600125 group and solvent control group.The rat model of cerebral ischemia was established. The p-14-3-3,the binding of 14-3-3 and Bax and the protein expression of Bax in cytoplasm and mitochondria in hippocampal CA1 region were detected by immunoprecipitation(IP)and immunoblotting 12-hour after ischemia-reperfusion in four groups.ResultsCompared with the sham operation group,protein expression levels of p-14-3-3 in cytoplasm and Bax in mitochondria were significantly increased,the binding of 14-3-3 and Bax was significantly decreased in ischemia-reperfusion group,solvent control group and SP600125 group.The protein expressions of p-14-3-3 and Bax were significantly lower in SP600125 group than those of ischemia-reperfusion group and solvent control group.The binding of 14-3-3 and Bax was significantly higher in SP600125 group than that of ischemia-reperfusion group and solvent control group(P＜0.05).Conclusion14-3-3 phosphorylation induced by JNK plays important effects on ischemic brain injury in rats.

14-3-3 proteins；JNK mitogen-activated protein kinases；bcl-2-associated X protein；brain ischemia

R743.31

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.07.008

國家自然科學基金資助項目（81371300）

徐州醫(yī)學院病原生物學與免疫學教研室（郵編221002）