華 晨 傅天嘯 傅永清 周 劍 蘭 菲 任大為

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 杭州 310006

四君子湯聯(lián)合缺血預(yù)處理對肝臟缺血再灌注損傷大鼠炎癥因子及氧化應(yīng)激的影響

華 晨 傅天嘯 傅永清 周 劍 蘭 菲 任大為

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 杭州 310006

目的觀察四君子湯聯(lián)合缺血預(yù)處理（IPC）對肝臟缺血再灌注損傷大鼠炎癥因子及氧化應(yīng)激的影響。方法80只SD大鼠隨機分成空白對照組、四君子湯預(yù)處理組、IPC組和四君子湯預(yù)處理+IPC組，每組20只。肝臟缺血再灌注術(shù)后檢測白細胞計數(shù)（WBC）、血小板計數(shù)（PLT）；血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）；血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6），以及肝組織中丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）水平。結(jié)果四君子湯預(yù)處理+IPC組WBC、ALT及AST水平顯著低于其余三組（P＜0.05）。四君子湯預(yù)處理組與IPC組的ALT、AST水平較空白對照組顯著降低（P＜0.05）。四君子湯預(yù)處理+IPC組TNF-α水平顯著低于其余三組（P＜0.05）。三個實驗組IL-6、MDA水平顯著低于空白對照組（P＜0.05），SOD水平顯著高于空白對照組（P＜0.05）。各實驗組間比較，四君子湯預(yù)處理+IPC組SOD水平高于其余兩組（P＜0.05）。結(jié)論四君子湯聯(lián)合IPC可減輕大鼠肝臟缺血再灌注過氧化損傷，抑制炎癥因子，保護肝功能。

大鼠；肝臟缺血再灌注損傷；四君子湯；缺血預(yù)處理；腫瘤壞死因子α；白介素6；丙二醛；超氧化物歧化酶

肝臟缺血再灌注損傷（hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI）是導(dǎo)致肝膽外科患者術(shù)后肝功能衰竭甚至死亡的主要原因，當(dāng)前無治療HIRI的有效方法[1]。HIRI發(fā)生機制復(fù)雜，目前認為氧化損傷、炎癥反應(yīng)是其病理生理機制的重要環(huán)節(jié)。近年來，針對發(fā)病機制的各種臨床預(yù)處理措施成為國內(nèi)外研究的熱點。中藥預(yù)處理具有靶點廣、副作用小等特點。本研究聯(lián)合中藥四君子湯及缺血預(yù)處理（ischemia preconditioning，IPC）作為干預(yù)手段，觀察其在大鼠HIRI過程中保護肝功能、減輕過氧化損傷、抑制炎癥反應(yīng)的作用及機制。

1 實驗材料

1.1動 物 健康雄性SD大鼠80只，7周齡，平均體質(zhì)量（220±40）g。由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心提供，動物許可證號：SYXK（浙）2008-0115。

1.2藥 品 3%戊巴比妥鈉；四君子湯藥物組成：人參12g，茯苓、白術(shù)各9g，炙甘草6g（中藥飲片購自浙江省中醫(yī)院），水煎煮2次，合并濾液濃縮至生藥含量為1g/mL，冰箱冷藏備用（實驗所用劑量均以生藥計）。

1.3主要儀器及試劑 動物手術(shù)器械、移液器、天平、DU800分光光度儀、組織勻漿機、恒溫水浴箱、脫色搖床等均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心提供。腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒、白介素6（IL-6）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

2 實驗方法

2.1分組及造模 80只大鼠隨機分為空白對照組、四君子湯預(yù)處理組、IPC組和四君子湯預(yù)處理+IPC組，每組20只。大鼠肝臟缺血再灌注模型按Nauta等方法制備。3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（0.13mL/ 100g），取上腹部正中切口進腹，顯露第一肝門部，用無損傷血管夾將門靜脈和肝動脈分支夾閉，阻斷入肝血流45min后，取下血管夾恢復(fù)肝臟供血。

2.2干預(yù)方法 空白對照組：缺血再灌注造模前予生理鹽水灌胃5天，1次2mL，1天1次；四君子湯預(yù)處理組：缺血再灌注造模前予四君子湯灌胃5天，1次2mL，1天1次；IPC組：缺血再灌注前予缺血預(yù)處理，方法為在持續(xù)阻斷肝血流前用無損傷血管鉗夾閉肝臟左、中葉肝蒂10min，松開血管鉗，使肝臟再灌注10min；四君子湯預(yù)處理+IPC組：缺血再灌注造模前予四君子湯灌胃，缺血預(yù)處理，方法同上。各組術(shù)后予常規(guī)補液治療。

持續(xù)性缺血再灌注術(shù)后24h采集標本。3%戊巴比妥鈉溶液麻醉（0.13mL/100g），5mL注射用針筒自大鼠心臟取血，剪取肝臟組織約10g左右，待檢。

2.3檢測指標 ①白細胞計數(shù)（WBC）、血小板計數(shù)（PLT）：取全血，采用血細胞計數(shù)儀檢測。②ALT、AST檢測：血液樣本3000r/min離心10min分離取血清，用全自動生化分析儀檢測AST、ALT水平。③血清TNF-α和IL-6含量測定：采用ELISA法測定，具體步驟按試劑盒進行。④肝組織中丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的測定：采用硫代巴比妥酸法測定各組肝組織中的MDA，羥胺法檢測SOD，按試劑盒說明進行。肝臟組織加9倍量的勻漿液，用勻漿機勻漿（操作在冰水浴中進行），制成10%勻漿液，3000r/min離心10min，取上清液。MDA含量測定：MDA可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產(chǎn)物，測吸光度值。SOD測定：通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，測其吸光度。

2.4統(tǒng)計學(xué)方法 所有計量資料用均數(shù)±標準差（） 表示，采用方差分析。使用SPSS20.0軟件包分析數(shù)據(jù)，以P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1各組大鼠血清WBC、PLT水平比較 四君子湯預(yù)處理+IPC組WBC水平顯著低于空白對照組、四君子湯預(yù)處理組和IPC組（P均＜0.05）。除四君子湯預(yù)處理+IPC組外，其余三組WBC比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。四組PLT水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠血清WBC、PLT水平比較（） ×109/L

表1 各組大鼠血清WBC、PLT水平比較（） ×109/L

注：與四君子湯預(yù)處理+IPC組比較，*P＜0.05

?

3.2各組大鼠血清ALT、AST水平比較 四君子湯預(yù)處理+IPC組ALT及AST水平較其余三組明顯降低（P＜0.05）。其余三組間比較，四君子湯預(yù)處理組與IPC組的ALT及AST水平較空白對照組明顯降低（P＜0.05）；四君子湯預(yù)處理組與IPC組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

3.3各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較 四君子湯預(yù)處理+IPC組TNF-α水平顯著低于其余三組（P均＜0.05）；空白對照組與四君子湯預(yù)處理組、IPC組間TNF-α水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。三個實驗組IL-6水平顯著低于空白對照組（P＜0.05）；而三個實驗組間IL-6差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表2 各組大鼠血清ALT、AST水平比較（） IU/L

表2 各組大鼠血清ALT、AST水平比較（） IU/L

注：與空白對照組比較，△P＜0.05；與四君子湯預(yù)處理+IPC組比較，*P＜0.05

組別空白對照組四君子湯預(yù)處理組IPC組四君子湯預(yù)處理+IPC組n/只20 20 20 20 ALT 230.56±97.91 168.21±59.33△* 136.61±41.19△* 89.24±63.67△AST 480.26±89.65 331.11±95.62△* 301.06±101.37△* 169.32±87.44△

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較（） pg/mL

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較（） pg/mL

注：與空白對照組比較，△P＜0.05；與四君子湯預(yù)處理+IPC組比較，*P＜0.05

?

3.4各組大鼠肝組織MDA、SOD水平比較 三個實驗組MDA水平顯著低于空白對照組（P＜0.05），SOD水平顯著高于空白對照組（P＜0.05）。三個實驗組間MDA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與四君子湯預(yù)處理組、IPC組比較，四君子湯預(yù)處理+IPC組SOD水平顯著升高（P＜0.05）；而四君子湯預(yù)處理組與IPC組間SOD水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 各組大鼠肝組織MDA、SOD水平比較（）

表4 各組大鼠肝組織MDA、SOD水平比較（）

注：與空白對照組比較，△P＜0.05；與四君子湯預(yù)處理+IPC組比較，*P＜0.05

組別空白對照組四君子湯預(yù)處理組IPC組四君子湯預(yù)處理+IPC組n/只20 20 20 20 MDA/（nmol/mgprot）0.91±0.51 0.67±0.22△0.72±0.17△0.59±0.25△SOD/（U/mgprot）31.23±12.32 60.51±19.72△* 49.12±14.38△* 81.54±35.19△

4 討論

預(yù)處理是目前改善HIRI患者臨床預(yù)后最有希望的措施[2]。所謂預(yù)處理是指在真正應(yīng)激發(fā)生前將細胞、組織、器官暴露于非致死性應(yīng)激中，以期獲得抵御真正應(yīng)激的能力。IPC與藥物預(yù)處理是最常用的兩種預(yù)處理措施。IPC是指預(yù)先使組織或器官經(jīng)歷短時間的缺血，以增強其對隨后較長時間缺血的耐受力。藥物預(yù)處理是指在長時間缺血前先使用如化療藥物及他汀類藥物，以激發(fā)機體的內(nèi)源性保護機制。IPC簡單易行，但是有損傷血管、致血栓形成的缺點；用于預(yù)處理的藥物同樣具有相應(yīng)副作用。中藥較西藥具有作用范圍廣，靶點多，副作用小的特點，有研究者運用丹參、參附注射液、銀杏葉提取物、三七總皂苷等進行動物實驗，并證實其對HIRI有保護作用[3]。四君子湯由人參、白術(shù)、茯苓、炙甘草組成，具有健脾益氣功效，為治療脾氣虛證經(jīng)典方劑。方中人參補益中氣，健脾和胃為君；白術(shù)溫脾燥濕為臣；佐以茯苓甘淡滲濕健脾，使以甘草養(yǎng)胃和中。全方共奏健脾和胃，益氣養(yǎng)血之功效。研究證明四君子湯具有減輕氧化應(yīng)激的作用[4]。

無論以何種方式引起的肝細胞損傷，其損傷程度可以直接由肝酶反映，因此再灌注損傷后肝酶水平是預(yù)處理方式對肝功能保護作用的重要評價指標。本研究中四君子湯預(yù)處理組或IPC組血清ALT、AST水平均較無處理空白對照組明顯降低，若四君子湯預(yù)處理+IPC聯(lián)合運用，則較單獨運用降酶效果更加顯著。

HIRI過程中，炎癥因子在肝內(nèi)以自分泌、旁分泌以及體液途徑等方式發(fā)揮著激發(fā)和維持炎癥反應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，從而調(diào)控著再灌注損傷。TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10等細胞因子既可通過單個形式也可通過彼此間協(xié)同作用引起肝細胞損傷[5]。本研究發(fā)現(xiàn)四君子湯預(yù)處理+IPC可以降低再灌注后血WBC（P＜0.05），單獨運用四君子湯預(yù)處理或IPC則無此效果，可能是兩者聯(lián)合運用而起到協(xié)同作用。三種預(yù)處理方法對PLT均無明顯影響，推測可能是PLT變化的時間及程度與WBC不同。四君子湯預(yù)處理+IPC可以顯著抑制HIRI后TNF-α和IL-6的釋放（P＜0.05）；單獨運用四君子湯預(yù)處理或IPC也可明顯抑制IL-6水平，但對TNF-α水平無影響?？梢娫谘装Y反應(yīng)及細胞因子的調(diào)控上，四君子湯預(yù)處理+IPC聯(lián)合運用較單獨運用對減輕炎癥反應(yīng)具有更可靠的作用。

HIRI是一種氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧自由基在HIRI時發(fā)揮重要作用，大量氧自由基的產(chǎn)生是導(dǎo)致HIRI的主要直接原因[6]。HIRI過程中，肝細胞缺血缺氧，ATP分解產(chǎn)物次黃嘌呤在缺血的肝組織內(nèi)大量積存，同時缺氧也使內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)如超氧化物歧化酶（SOD）失活或耗盡；缺血還可促進胞內(nèi)黃嘌呤脫氫酶向黃嘌呤氧化酶轉(zhuǎn)化，后者在催化次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為黃嘌呤的同時可利用胞內(nèi)分子氧產(chǎn)生大量的氧自由基。組織細胞過氧化損傷后產(chǎn)生大量脂質(zhì)過氧化物，MDA是這些脂質(zhì)過氧化物最終裂解生成的主要終末產(chǎn)物之一，故MDA水平與過氧化損傷程度呈正相關(guān)。SOD是一種金屬酶類，主要作用為催化超氧離子的歧化過程，清除氧自由基，在肝臟的缺血再灌注損傷中，對細胞起保護作用[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)四君子湯預(yù)處理+IPC聯(lián)合使用可顯著降低MDA，提高SOD水平，兩者聯(lián)合較單獨使用四君子湯預(yù)處理或IPC能更顯著地提高SOD水平，而MDA水平則無明顯變化。顯示兩者聯(lián)合使用能更有效地提高機體清除氧自由基的能力。

本研究結(jié)果顯示，IPC和中藥四君子湯通過減少炎癥因子釋放、抗過氧化損傷對HIRI起保護作用，兩者聯(lián)合運用效果更佳。然而氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是由復(fù)雜的、多通路的細胞因子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成。兩者之間相互影響，其中仍有很多未知的機制，需要進一步實驗研究來發(fā)現(xiàn)和證實。四君子湯預(yù)處理聯(lián)合IPC作為新的預(yù)處理手段，需要更多前瞻性臨床試驗支持。

［1］孔瑞，孫備，潘尚哈,等.缺血預(yù)處理聯(lián)合丹酚酸B對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護作用［J］.中華肝膽外科雜志，2010，16（12）：951-953.

［2］麻勇，姜洪池.肝臟缺血再灌注損傷的實驗研究現(xiàn)狀與展望［J］.中華實驗外科雜志，2012，29（10）：1880-1882.

［3］金鈴，方劍喬.中藥預(yù)處理對肝缺血再灌注損傷防護作用的研究進展［J］.甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，27（1）：63-65.

［4］傅永清，華晨，陳炳榮,等.四君子湯聯(lián)合快速康復(fù)外科干預(yù)肝臟缺血再灌注損傷的實驗研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，35（11）：757-760，795.

［5］康凱，姜洪池，趙鳴雁，等.胱硫醚-γ-裂解酶/硫化氫系統(tǒng)在大鼠肝臟缺血再灌注損傷中的保護作用［J］.中華外科雜志，2010，48（12）：924-928.

［6］林杰，曾仲.缺血后處理對肝臟缺血再灌注的保護機制研究進展［J］.世界華人消化雜志，2010，18（17）：1799-1803.

［7］陳亮，顏王鑫，唐蘭蘭，等.L-精氨酸對兔缺血再灌注損傷肝臟能量代謝的影響［J］.肝膽胰外科雜志，2010，22（3）：200-202.

［8］Fu YQ，Hua C，Zhou J，et al.Protective effects of ginseng total saponins against hepatic ischemia/reperfusion injury in experimental obstructive jaundice rats［J］.Pharm Biol，2013，51（12）：1545-1551.

Effect of Sijunzi Decoction Combined with Ischemia Preconditioning on Inflammatory Mediators and Oxidative Stress in Rats with Hepatic Ischemia/Reperfusion Injury

HUA Chen,FU Tianxiao,FU Yongqing,ZHOU Jian,et al. Department of Surgery,First Hospital Affiliated to Zhejiang Traditional Medical University,Hangzhou (310006),China

ObjectiveTo investigate the effect of Sijunzi decoction and ischemia preconditioning（IPC）on inflammatory mediators and oxidative stress in rats with hepatic ischemia-reperfusion.MethodsEighty SD rats were randomly divided into SHAM,Sijunzi decoction,IPC,and Sijunzi decoction+IPC groups（n=20 in each group）.After hepatic ischemia-reperfusion,the levels of white blood cell count（WBC）,platelet,alanine aminotransferase（ALT）, aspartate aminotransferase（AST）,tumor necrosis factor-alpha（TNF-α）,interleukin-6（IL-6）,and malondialdehyde（MDA）and superoxide dismutase（SOD）were measured.ResultsThe levels of WBC,ALT and AST in Sijunzi decoction+IPC group was significantly lower than those in other 3 groups（P＜0.05）.The levels of ALT and AST in Sijunzi decoction and IPC groups were significantly lower than those in sham group（P＜0.05）.The level of TNF-αin Sijunzi decoction+IPC group was significantly lower than that in other 3 groups（P＜0.05）.Compared with other 3 groups,the levels of IL-6 and MDA in sham group was significantly higher and SOD was significantly lower（Ps＜0.05）.The level of SOD in Sijunzi decoction+IPC group was significantly higher than that in Sijunzi decoction group and IPC group（P＜0.05）.ConclusionSijunzi decoction combined with IPC can reduce hepatic ischemiareperfusion injury in rats by alleviating inflammatory reaction,improving antioxidation capacity.

hepatic ischemia reperfusion injury；Sijunzi decoction；ischemia preconditioning；tumor necrosis factor-alpha；interleukin-6；malondialdehyde；superoxide dismutase

2013-12-24

浙江省教育廳科研項目（No.Y201120554）

華晨，Tel：13858142323；E-mail：worson78@163.com