羅麗丹王鑫華童夏生馮利平王恩智

1浙江省溫嶺市第四人民醫(yī)院兒科 臺(tái)州 317523 2浙江省臺(tái)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院

呼吸道感染患兒血清Toll樣受體、Dectin及CD14測(cè)定臨床意義

羅麗丹1王鑫華2童夏生2馮利平2王恩智2

1浙江省溫嶺市第四人民醫(yī)院兒科 臺(tái)州 317523 2浙江省臺(tái)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院

呼吸道感染；兒童；Toll樣受體；Dectin；CD14；臨床意義

機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)感染的識(shí)別及應(yīng)答依賴(lài)于模式識(shí)別受體，Toll樣受體（TLR）被認(rèn)為是最主要的模式識(shí)別受體[1]，參與感染、哮喘、腫瘤等疾病的炎癥過(guò)程。最近研究發(fā)現(xiàn)TLR2、6與Dectin、膜蛋白細(xì)胞分化抗原14（CD14）等模式識(shí)別受體具有協(xié)同作用，共同對(duì)微生物和外源性分子等產(chǎn)生免疫應(yīng)答，它們通過(guò)髓樣分化因子（MyD88）/NF-κB途經(jīng)產(chǎn)生TNFα、IL-12等炎癥因子起到相互增強(qiáng)作用[2]。本研究檢測(cè)毛細(xì)支氣管炎和急性上呼吸道感染患兒血清模式識(shí)別受體TLR2、Dectin及可溶性CD14（sCD14）的表達(dá)，以了解血清模式識(shí)別受體在兒童呼吸道感染中的發(fā)病機(jī)制，報(bào)道如下。

1 臨床資料

選取2011年10月—2012年8月本院住院患兒118例，其中毛細(xì)支氣管炎[3]53例，男31例，女22例；年齡0.3～4歲，平均（1.9±0.9）歲；急性上呼吸道感染[3]65例，男39例，女26例；年齡0.5～4歲，平均（2.1±1.0）歲；病程均＜48h。并取30名門(mén)診健康體檢兒童為健康對(duì)照組，男17名，女13名；年齡0.41～4歲，平均（2.0±1.1）歲。三組年齡、性別比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2 方法

采集患兒入院當(dāng)天靜脈血2mL，對(duì)照組門(mén)診體檢時(shí)采集。靜置2h后3000r/min離心15min，分離血清，-80℃冰箱貯存，集中檢測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法，檢測(cè)血清TLR2、Dectin及sCD14的蛋白濃度，試劑盒均購(gòu)自上海研吉生物科技有限公司。

測(cè)定方法：試劑盒平衡于室溫20～25℃待用，取96孔反應(yīng)板，加入40μL標(biāo)品于反應(yīng)孔里，然后再加生物素標(biāo)記的TLR2、Dectin及sCD14抗體各10μL，輕輕晃動(dòng)混勻。用封板膜封板后置37℃溫育30min，洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后洗滌5次，每孔加入酶標(biāo)試劑50μL，再經(jīng)溫育、洗滌，每孔先加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min，每孔加終止液50μL終止反應(yīng)，以空白空調(diào)零，全自動(dòng)酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystems Dragon公司）450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)各標(biāo)本吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)濃度。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，采用F檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

毛細(xì)支氣管炎組和急性上呼吸道感染組血清TLR2、Dectin及sCD14蛋白濃度均顯著高于健康對(duì)照組（P＜0.01）；毛細(xì)支氣管炎組血清Dectin蛋白濃度顯著高于急性上呼吸道感染組（P＜0.01），兩組血清TLR2和sCD14差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 三組血清TLR2、Dectin及sCD14比較（） ng/mL

表1 三組血清TLR2、Dectin及sCD14比較（） ng/mL

注：與健康對(duì)照組比較，*P＜0.01；與急性上呼吸道感染組比較，△P＜0.01

?

4 討論

天然免疫是機(jī)體識(shí)別和清除外源性病原體的主要途經(jīng)，是環(huán)境暴露和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子應(yīng)答的重要環(huán)節(jié)。急性上呼吸道感染和毛細(xì)支氣管炎是兒童最為常見(jiàn)的急性感染性疾病，主要由呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒等感染引起，繼而機(jī)體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)[4]。

介導(dǎo)天然免疫的主要模式識(shí)別受體包括TLR、Dectin、CD14、核苷酸寡聚化域樣受體和維A酸誘導(dǎo)基因Ⅰ樣受體等。TLR屬于Ⅰ型跨膜蛋白，表達(dá)于細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)胞外區(qū)的亮氨酸的重復(fù)序列，特異性識(shí)別病毒，并啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，發(fā)揮抗病毒作用，它還與其它模式識(shí)別受體之間具有相互協(xié)同作用。Dectin是一個(gè)包涵細(xì)胞外C型凝集素樣碳水化合物識(shí)別域的糖基化的Ⅱ型跨膜受體，主要表達(dá)于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞上，通過(guò)這些細(xì)胞的吞噬作用達(dá)到清除病原體的目的，并產(chǎn)生大量的炎癥因子和細(xì)胞因子。還能通過(guò)β-葡聚糖和非β-葡聚糖依賴(lài)性方式與T細(xì)胞相互作用，促進(jìn)Th1/Th17細(xì)胞的活化及Treg細(xì)胞的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生免疫記憶[5]。不僅在支氣管上皮細(xì)胞的真菌感染中起重要作用[6]，還能使肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)H1N1流感病毒A型產(chǎn)生天然免疫應(yīng)答，產(chǎn)生大量的干擾素、炎癥因子和趨化因子[7]。CD14表達(dá)于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞上，有膜結(jié)合型（mCD14）和可溶性?xún)煞N形式。CD14和脂多糖、脂多糖結(jié)合蛋白一起形成一種復(fù)合體，與細(xì)胞膜上Toll樣受體結(jié)合，介導(dǎo)機(jī)體細(xì)菌或病毒感染的天然免疫過(guò)程。在巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌肺炎和壞死性肺炎的天然免疫反應(yīng)中，潘頓-瓦倫丁殺白細(xì)胞素是通過(guò)TLR2、CD14、MyD88、白介素1受體相關(guān)激酶、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6依賴(lài)的方式產(chǎn)生免疫反應(yīng)[8]。在HIV-2感染的患者中，血清sCD14的濃度升高與病情危重程度有關(guān)，還與高敏C反應(yīng)蛋白及IL-6等生物標(biāo)記物呈正相關(guān)，認(rèn)為它是一個(gè)能預(yù)測(cè)病情的炎癥標(biāo)記物[9]。在呼吸道合胞病毒感染的毛細(xì)支氣管炎患者中，血清sCD14的濃度與病情的進(jìn)展有關(guān)，其程度受基因多態(tài)性影響[10]，還與喘鳴的發(fā)作次數(shù)有關(guān)，有喘鳴再次發(fā)作的患者低于不再喘息發(fā)作的患者，提示它傾向于Th1發(fā)展趨勢(shì)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，血清TLR2、Dectin、sCD14的蛋白濃度在毛細(xì)支氣管炎組及急性上呼吸道感染組中升高，提示它們共同參與呼吸道感染的天然免疫應(yīng)答；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)毛細(xì)支氣管炎組血清Dectin蛋白濃度高于急性上呼吸道感染組，而TLR2和sCD14的蛋白濃度無(wú)差異，提示Dectin的反應(yīng)可能因病而異，對(duì)判斷疾病或許有一定的參考價(jià)值，而TLR2和sCD14對(duì)病毒的應(yīng)答可能沒(méi)有選擇性差異。相似的研究發(fā)現(xiàn)，在上呼吸道感染小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，肺組織TLR3的表達(dá)升高，而在恢復(fù)期降到正常水平[12]，進(jìn)一步提示TLR在上呼吸道感染的免疫反應(yīng)中也起了一定的作用。

綜上所述，毛細(xì)支氣管炎及急性上呼吸道感染患兒血清TLR2、Dectin、sCD14濃度升高（P＜0.01），提示在呼吸道感染急性期模式識(shí)別受體被激活，從而提升機(jī)體清除病原體的能力。檢測(cè)患兒模式識(shí)別受體的表達(dá)，為毛細(xì)支氣管炎及急性上呼吸道感染發(fā)病機(jī)制的研究提供了理論依據(jù)，為判斷病情提供參考價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

［1］Wei L，Jiao P，Yuan R，et al.Goose Toll-like receptor 7（TLR7），myeloid differentiation factor 88（MyD88）and antiviral molecules involved in anti-H5N1 highly pathogenic avian influenza virus response［J］.Vet Immunol Immunopathol，2013，153（1-2）：99-106.

［2］Dennehy KM，Willment JA，Williams DL，et al.Reciprocal regulation of IL-23 and IL-12 following co-activation of Dectin-1 and TLR signaling pathways［J］.Eur J Immunol，2009，39（5）：1379-1386.

［3］胡亞美，江載芳.諸福棠實(shí)用兒科學(xué)［M］.第7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1199-1201.

［4］李晨虹，童夏生，羅冬嬌，等.腫瘤壞死因子-α及其受體在急性毛細(xì)支氣管炎患者血清中的表達(dá)［J］.中國(guó)婦幼保健，2011，26（8）：1210-1212.

［5］Carvalho A，Giovannini G，De Luca A，et al.Dectin-1 isoforms contribute to distinct Th1/Th17 cell activation in mucosal candidiasis［J］.Cell Mol Immunol，2012，9（3）：276-286.

［6］Sun WK，Lu X，Li X，et al.Dectin-1 is inducible and plays a crucial role in Aspergillus-induced innate immune responses in human bronchial epithelial cells［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2012，31（10）：2755-2764.

［7］Jieru Wang，Mrinalini P.Nikrad，Emily A.Travanty，et al.Innate Immune Response of Human Alveolar Macrophages during Influenza a Infection［J］.PLoS One，2012，7（3）：e29879.

［8］Zivkovic A，Sharif O，Stich K，et al.TLR 2 and CD14 mediate innate immunity and lung inflammation to staphylococcal Panton-Valentine leukocidin in vivo［J］.J Immunol，2011，186（3）：1608-1617.

［9］Thiébaut R，Charpentier C，Damond F，et al.Association of soluble CD14 and inflammatory biomarkers with HIV-2 disease progression［J］.Clin Infect Dis，2012，55（10）：1417-1425.

［10］Inoue Y，Shimojo N，Suzuki Y，et al.CD14-550 C/T，which is related to the serum level of soluble CD14,is associated with the development of respiratory syncytial virus bronchiolitis in the Japanese population［J］.J Infect Dis，2007，195（11）：1618-1624.

［11］Soferman R，BarZohar D，Jurgenson U，et al.Soluble CD14 as a predictor of subsequent development of recurrent wheezing in hospitalized young children with respiratory syncytial virus-induced bronchiolitis［J］.Ann Allergy Asthma Immunol，2004，92（5）：545-548.

［12］鄭艷，耿連藝，盛夏，等.上感顆粒對(duì)病毒性上呼吸道感染小鼠肺組織TLR3及PKR mRNA表達(dá)的影響［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，31（3）：410-413.

2013-08-06

修回日期：2013-12-16

浙江省溫嶺市科技局基金資助項(xiàng)目（No.2011-1-85）

通迅作者：童夏生，E-mail：xshtzg@163.com