劉俊等

摘要：從80對玉米（Zea mays L.）SSR引物中篩選出26對擴(kuò)增帶型穩(wěn)定性較高的引物，利用這些SSR引物對70份國內(nèi)外收集引進(jìn)的玉米自交系和6個(gè)國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)測驗(yàn)種進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，26對引物在76份玉米材料中共檢測到80個(gè)等位基因位點(diǎn)，每對引物檢測出2～6個(gè)等位基因，平均3.08個(gè)；每個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量變化范圍為0.18～0.80，平均為 0.45。UPGMA聚類結(jié)果表明，70份玉米自交系可劃分為PA、Lancaster、旅大紅骨、四平頭、PB、BSSS 6個(gè)雜種優(yōu)勢類群。

關(guān)鍵詞：玉米（Zea mays L.）自交系；SSR標(biāo)記；遺傳多樣性；雜種優(yōu)勢群

中圖分類號：S513；Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）06-1256-04

Genetic Diversities and Heterotic Groups of 70 Maize Inbred Lines

with SSR Markers

LIU Jun1，YIN Xiao-hong1，GUO Zhi-fu2，LIU Jun1，LIU Xu1，LI Hui1，JING Xi-qiang1

（1.Maize Institute， Dandong Academy of Agricultural Sciences， Fengcheng 118109， Liaoning， China；

2.Biological Science and Technology College， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110161， China）

Abstract： The genetic diversities of 70 maize inbred lines and 6 domestic standard testers were analyzed with SSR markers. 26 polymorphic SSR primes were screened from 80 SSR primers. The results showed that 80 alleles were detected in 26 primers among 76 maize inbred lines. The number of alleles per SSR locus was ranged from 2 to 6 with an average of 3.08. The value of polymorphism information content（PIC） for each SSR locus varied from 0.18 to 0.80 with an average of 0.45. The results of UPGMA analysis showed that 70 maize inbred lines were classified into 6 heterotic groups （i. e. PA， Lancaster， Lvda Red Cob， Sipingtou， PB and BSSS）.

Key words： maize（Zea mays L.） inbred lines； SSR （simple sequence repeats marker）； genetic diversity； heterotic group

雜種優(yōu)勢利用是大幅度提高玉米（Zea mays L.）產(chǎn)量和改良品質(zhì)的有效途徑。解析自交系群體遺傳結(jié)構(gòu)，分析自交系類群遺傳多樣性和類群間遺傳關(guān)系是改良自交系和確定雜種優(yōu)勢模式的基礎(chǔ)，對提高玉米育種效率具有重要指導(dǎo)意義。

玉米不僅是中國重要的糧食作物，同時(shí)在飼料、化工、醫(yī)藥、輕工和經(jīng)貿(mào)等行業(yè)都是重要的產(chǎn)品和原料。隨著人們生活水平的逐步提高和膳食結(jié)構(gòu)的不斷改善， 中國玉米消費(fèi)呈明顯的剛性增長趨勢，消費(fèi)結(jié)構(gòu)逐漸由過去的口糧消費(fèi)為主轉(zhuǎn)向飼料、工業(yè)加工為主的多方向、多領(lǐng)域、多層次消費(fèi)[1]。然而，由于中國不是玉米的起源中心，種質(zhì)資源十分匱乏，所以引進(jìn)種質(zhì)源并與中國當(dāng)前所擁有的玉米種質(zhì)資源進(jìn)行整合和分析就顯得更加重要[2]。

近年來，隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)特別是SSR標(biāo)記的發(fā)展和應(yīng)用，為種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究提供了新的手段。SSR等分子標(biāo)記可以分析玉米自交系間的遺傳差異，并能迅速把來源不明的自交系劃到相應(yīng)的類群。目前，SSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于玉米種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究。李新海等[3]利用SSR標(biāo)記分析了70份玉米自交系的遺傳多樣性，并用UPGMA（Unweighted pair-group method with arithmetic means）法將70份玉米自交系劃分為四平頭、旅大紅骨、PA、PB、BSSS和Lancaster 6個(gè)類群。孫友位等[4]利用SSR標(biāo)記的基于模型的聚類方法將85個(gè)自交系分為6個(gè)亞群，并提出6個(gè)亞群可以合并成A（Reid、熱帶種質(zhì)、旅大紅骨）和B（Lancaster、塘四平頭、農(nóng)家種）兩大種質(zhì)類群。Xie等[5]根據(jù)SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)，利用基于混合模型的聚類法將中國常用的187個(gè)玉米自交系劃分為6個(gè)亞群，并分析了類群間的遺傳關(guān)系，將6個(gè)亞群合并成A（Lancaster、BSSS、PA）、B（PB）和C（塘四平頭、旅大紅骨）3組。Smith等[6]用113對SSR引物對58份玉米自交系進(jìn)行了遺傳多樣性分析，認(rèn)為運(yùn)用SSR技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性分析更為優(yōu)越，并與系譜來源基本一致。Senior等[7]用70對SSR標(biāo)記對94份玉米自交系進(jìn)行分析，共檢測到365個(gè)等位基因，用SSR標(biāo)記對其進(jìn)行聚類分析，其結(jié)果與系譜吻合。這些研究表明，SSR標(biāo)記在遺傳多樣性分析方面更具優(yōu)勢。

本研究利用26對SSR引物對70份國內(nèi)外收集引進(jìn)的玉米自交系進(jìn)行了遺傳多樣性分析，以期快速對外引玉米種質(zhì)資源進(jìn)行雜種優(yōu)勢群分類，為提高玉米育種效率和進(jìn)行玉米種質(zhì)資源改良與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為丹東市農(nóng)業(yè)科學(xué)院從國內(nèi)外收集引進(jìn)的70份玉米自交系和6份國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)測驗(yàn)種（掖478、黃早四、齊319、Mo17、B73和丹340）。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取與檢測 采用Saghai-Maroof等[8]提出的CTAB法提取玉米葉片總DNA。并用紫外分光光度計(jì)測量DNA濃度和相對純度，用去離子水將DNA稀釋至20 ng/μL，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物篩選 結(jié)合CIMMYT公布的玉米核心SSR引物，選取位于玉米10條染色體上的80對引物，并從中篩選出26對帶型清晰穩(wěn)定性好的引物進(jìn)行SSR分析。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增在DNA Engie-PTC-200反應(yīng)儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 μL，其中10×PCR Buffer 2.00 μL，30 mmol/L Mg2+1.68 μL，25 mmol/L dNTPs 0.32 μL，5U/μL Tag酶0.20 μL，30 ng/μL的引物各1.00 μL，20 ng/μL DNA 2.50 μL，ddH2O 11.30 μL。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳 擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的聚丙烯酰胺變性凝膠電泳進(jìn)行檢測，記錄結(jié)果并照相。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)SSR產(chǎn)物銀染結(jié)果，有帶記為1，無帶記為0，數(shù)據(jù)缺失記為9，建立數(shù)據(jù)庫。采用Nei等的公式計(jì)算各自的遺傳相似系數(shù)（Genetic similarity，GS）和遺傳距離（Genetic distance，GD）。GS=2Nij/（Ni+Nj）； GD=1-GS。式中，Nij為第i個(gè)材料和第j個(gè)基因型間共有的條帶數(shù)；Ni和Nj分別為第i個(gè)材料和第j個(gè)材料各自的特有條帶數(shù)。然后按照UPGMA方法，采用NTsys 2.10e軟件對各個(gè)自交系進(jìn)行聚類。每一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量（PIC） 按Smith等[6]的公式計(jì)算，PIC=1，式中，fi為i位點(diǎn)的基因頻率，數(shù)據(jù)處理由統(tǒng)計(jì)分析軟件PowerMarker V3.25完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

從80對玉米SSR引物中篩選出26對擴(kuò)增帶型穩(wěn)定性較高的引物進(jìn)行SSR分析，由表1可知，在70份玉米自交系及6份國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)測試種中共檢測到80個(gè)等位基因位點(diǎn)，每對引物檢測出2～6個(gè)等位基因，平均每對引物檢測出3.08個(gè)等位基因。80個(gè)SSR位點(diǎn)檢測出76份玉米材料的平均多態(tài)信息含量為0.45，變化范圍為0.18～0.80。

2.2 70份玉米自交系的類群劃分

根據(jù)76份玉米材料遺傳相似系數(shù)矩陣，利用UPGMA方法對供試自交系進(jìn)行聚類分析。根據(jù)聚類分析樹狀圖（圖1），在遺傳相似系數(shù)為0.73時(shí)，可將70份玉米自交系和6份國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)測試種分為6大類，第Ⅰ類包括掖478在內(nèi)的34份自交系，屬于PA類群；第Ⅱ類包括Mo17在內(nèi)的21份自交系，屬Lancaster類群；第Ⅲ類包括丹340在內(nèi)的8份自交系，屬旅大紅骨類群；第Ⅳ類包括黃早四在內(nèi)的3份自交系，屬四平頭類群；第Ⅴ類是包括齊319在內(nèi)的5份自交系，屬PB類群；第Ⅵ類是包括B73在內(nèi)的5份自交系，屬BSSS類群。

3 結(jié)論

玉米育種的前提是擁有豐富的種質(zhì)資源，對此必須以雜種優(yōu)勢群的形式將其分類、鑒定和加以改良，然后建立相應(yīng)的雜種優(yōu)勢模式，才能有的放矢地選配雜交組合，大大減少育種的盲目性，從總體上提高育種水平和工作效率。本研究利用26對SSR引物對70份國內(nèi)外收集引進(jìn)的玉米自交系及6份國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)測試種進(jìn)行了遺傳多樣性研究，其多態(tài)性信息含量為0.18～0.80，變異范圍較大，表明玉米自交系遺傳多樣性較高。利用UPGMA對70份玉米自交系進(jìn)行聚類，在遺傳相似系數(shù)為0.73時(shí)，可將70份玉米自交系劃分為6大類。

本研究中，26對SSR引物在70份玉米自交系及6份國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)測試種中共檢測到80個(gè)等位基因位點(diǎn)，每對引物檢測到2～6個(gè)等位基因，平均每對引物檢測到3.08個(gè)等位基因，這相對于國內(nèi)外普通玉米以及糯玉米自交系研究而言較低。陳婧等[9]用32對SSR引物對40份糯玉米自交系進(jìn)行遺傳多樣性分析，共檢測出152個(gè)等位基因變異，平均為4.75個(gè)；Lu等[10]用83對SSR引物分析了40份美國溫帶普通玉米自交系，檢測到的平均等位基因變異（4.9個(gè)）也高于本研究，這可能與玉米材料的來源不夠廣泛以及SSR引物的篩選不夠合理有關(guān)，在以后的育種過程中應(yīng)該注重自身擁有資源的研究和整理，加強(qiáng)玉米育種的種質(zhì)資源庫建設(shè)。

利用SSR標(biāo)記技術(shù)對玉米自交系間遺傳關(guān)系的分析可以克服常規(guī)系譜分析法的不足，對于玉米種質(zhì)資源的改良、擴(kuò)增和進(jìn)一步提高雜交組合的組配效率具有十分重要的參考價(jià)值。在本研究中，70份自交系材料的系譜信息未知，但是用SSR標(biāo)記可以將其與國內(nèi)的6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)測驗(yàn)種進(jìn)行較好的聚類，說明本研究所選擇的SSR標(biāo)記可以較好地區(qū)分6個(gè)測驗(yàn)種，而將外引材料劃歸到我國廣泛采用的6大雜種優(yōu)勢群，為更好地利用這70份玉米自交系材料打下了基礎(chǔ)。

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