黃彬濤 趙衛(wèi)紅 肖 鎮(zhèn) 高 大

高三尖杉酯堿增強(qiáng)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞對(duì)于伊馬替尼敏感性的研究*

黃彬濤①趙衛(wèi)紅②肖 鎮(zhèn)①高 大①

目的：研究高三尖杉酯堿（HHT）增強(qiáng)慢性粒細(xì)胞白血病（CML）細(xì)胞對(duì)伊馬替尼（IM）敏感性的機(jī)制。方法：采集1例CML患者骨髓血標(biāo)本，經(jīng)體外篩選、克隆建立人白血病細(xì)胞株NPHA1（初治）和NPHA2（復(fù)發(fā)）。RNA干擾NPHA2細(xì)胞的EphB4蛋白表達(dá)，建立NPHA2-EphB4-sh細(xì)胞株。結(jié)果：與NPHA1細(xì)胞相比，耐IM的NPHA2細(xì)胞中EphB4過(guò)表達(dá)；在NPHA2-EphB4-sh細(xì)胞中，EphB4表達(dá)顯著低于NPHA1細(xì)胞和NPHA2細(xì)胞（P＜0.001）。NPHA2細(xì)胞對(duì)IM有明顯耐藥性（IC50=5.45 mg/L），但NPHA2-EphB4-sh對(duì)IM敏感性增加（IC50=0.93 mg/L，P＜0.001）。HHT與IM共處理后，NPHA2細(xì)胞對(duì)IM的IC50值降至1.17 mg/L（P＜0.001）。蛋白磷酸化測(cè)定表明HHT抑制了EphB4/RhoA通路表達(dá)。結(jié)論：EphB4/RhoA是一個(gè)新的IM耐藥途徑。HHT通過(guò)抑制EphB4/RhoA途徑，使IM治療獲得優(yōu)勢(shì)。

高三尖杉酯堿 伊馬替尼 慢性髓系白血病

促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞受體（erythropoietin-producing hepatocyte receptors，Eph）是最大的酪氨酸激酶受體蛋白家族［1］。EphB4是受體Eph蛋白家族成員之一，在腫瘤形成、細(xì)胞間相互作用（包括細(xì)胞間連接、黏附、遷移和排斥）中均具有重要作用［2-3］。2003年Ohmine等［4］研究證實(shí)RhoA激酶信號(hào)參與了白血病對(duì)伊馬替尼（imatinib，IM）的耐藥。本研究組前期報(bào)道，EphB4在K562細(xì)胞株和慢性髓細(xì)胞白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）患者細(xì)胞株中表達(dá)水平均存在差異，對(duì)于IM產(chǎn)生耐藥起到重要作用［5-6］，相關(guān)蛋白途徑的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，EphB4通過(guò)活化RhoA蛋白，產(chǎn)生對(duì)CML的耐藥作用。

高三尖杉酯堿（homoharringtonine，HHT）廣泛用于抗髓系白血病治療［7］，近期文獻(xiàn)報(bào)道，HHT對(duì)于單純依賴IM不能取得遺傳學(xué)緩解的CML患者，有肯定療效［8］，HHT聯(lián)合IM可以作為進(jìn)展/耐藥CML的一線治療方案［9］。蛋白電泳發(fā)現(xiàn)［10］，在K562細(xì)胞株中，HHT能夠增強(qiáng)DJ-1蛋白表達(dá)水平，而蛋白組學(xué)分析認(rèn)為，DJ-1蛋白可以下調(diào)EphB4表達(dá)，這意味著HHT具有潛在調(diào)控EphB4表達(dá)水平的作用。那么HHT增強(qiáng)IM治療敏感性的主要作用機(jī)制是否同干擾EphB4表達(dá)相關(guān)呢？本研究將進(jìn)一步探討HHT在EphB4主導(dǎo)的IM耐藥中的角色和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床病例與細(xì)胞株來(lái)源 本實(shí)驗(yàn)研究以2010年確診的1例CML病例（76歲，男性）作為研究對(duì)象。該患者初始接受IM治療，獲得分子生物學(xué)緩解，但2年后復(fù)發(fā)。初診和復(fù)發(fā)時(shí)起染色體核型均為46，XX，t（9；22）（q34；q11），相關(guān)突變檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)異常。經(jīng)患者知情同意，分別采集初治和難治時(shí)骨髓血標(biāo)本，體外培養(yǎng)、FISH熒光下分選BCR/ABL陽(yáng)性表達(dá)的單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)克隆、傳代、建立NPHA1和NPHA2細(xì)胞株。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 羊抗人EphB4多克隆抗體（R&D，美國(guó)），抗磷酸化Rac1+Cdc42抗體（Cst，美國(guó)），鼠抗人β-actin單克隆抗體（Santa cruz，美國(guó)），低分子量蛋白Marker（20～118 kD，上海申博生物公司），低分子量DNA Marker（東洋坊公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 建立穩(wěn)定低表達(dá)EphB4的NP-HA2細(xì)胞株（NPHA2-EphB4-sh） 按照既往方案［5-6］，采用ABI在線軟件設(shè)計(jì)針對(duì)EPHB4的干擾序列，委托invitrogen公司合成。構(gòu)建慢病毒載體，慢病毒包裝感染處理組，加入3種慢病毒載體進(jìn)行感染；陰性對(duì)照組，加入慢病毒空載體進(jìn)行感染；空白對(duì)照組，加入300 μL培養(yǎng)基。流式細(xì)胞儀分選有綠色熒光蛋白表達(dá)的細(xì)胞，測(cè)定綠色熒光蛋白陽(yáng)性率超過(guò)68%。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 分別取各組細(xì)胞株，按5×104/孔的細(xì)胞濃度加于96孔培養(yǎng)板；根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別用不同濃度的IM處理各組細(xì)胞。每個(gè)濃度組均設(shè)3個(gè)平行孔和空白對(duì)照；37℃，5% CO2環(huán)境培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，測(cè)量各孔OD值。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.3 RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞株EphB4 mRNA表達(dá)提取RNA、檢測(cè)總RNA純度和濃度的檢測(cè)，所提取的RNA樣品的OD260/OD280的比值應(yīng)在1.8～2.0之間。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR擴(kuò)增目的基因EphB4片斷，Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列［6］。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像光密度分析儀記錄圖像并行光密度分析。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞株EphB4蛋白表達(dá)灌注4%聚丙烯酰胺濃縮膠，含50 μL蛋白的溶液體積即為上樣量。積沉膠電壓80伏。轉(zhuǎn)膜電壓仍為120伏。EphB4分子量為108 kD、轉(zhuǎn)膜時(shí)間120 min，β-actin分子量為43 kD，轉(zhuǎn)膜時(shí)間60 min。5%脫脂乳溶液搖床封閉后，加入EphB4蛋白一抗（1：1 000），4℃搖床過(guò)夜，次日二抗（1：5 000）搖床孵育1 h。曝光、經(jīng)UVP凝膠成像系統(tǒng)掃描，取各電泳條帶的吸光度，β-actin做為內(nèi)參照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以SPSS 10.0軟件處理。全程實(shí)驗(yàn)結(jié)果獨(dú)立重復(fù)3次，計(jì)量資料用±s描述。依據(jù)細(xì)胞增殖抑制率，采用SPSS-Regression-probit程序計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）［10］。不同細(xì)胞株間EphB4蛋白及其mRNA檢測(cè)結(jié)果比較采用單因素方差分析。若整體組間均數(shù)存在顯著性差異，做多重比較。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低表達(dá)EphB4的NPHA2-EphB4-sh細(xì)胞恢復(fù)對(duì)伊馬替尼的敏感性

復(fù)發(fā)耐藥的NPHA2細(xì)胞株中，EphB4 mRNA和蛋白水平均成高表達(dá)狀態(tài)，RNA干擾構(gòu)建的NPHA 2-EphB4-sh細(xì)胞株中，EphB4 mRNA和蛋白水平顯著下降，低于NPHA1和NPHA2細(xì)胞水平（P＜0.01，圖1）。MTT法檢測(cè)表明，NPHA2細(xì)胞株保持著對(duì)IM的高耐藥性（IC50=5.45 mg/L），而低表達(dá)EphB4的NPHA2-EphB4-sh細(xì)胞，恢復(fù)了對(duì)IM的敏感性（IC50= 0.93 mg/L，P＜0.01，表1）。

圖1 不同細(xì)胞株EphB4在mRNA和蛋白水平的表達(dá)Figure 1 Expression of EphB4 mRNA and protein in cell lines

表1 NPHA細(xì)胞對(duì)伊馬替尼耐藥性的變化（±s）Table 1 IM resistance to change for NPhA cell（±s）

表1 NPHA細(xì)胞對(duì)伊馬替尼耐藥性的變化（±s）Table 1 IM resistance to change for NPhA cell（±s）

*P＜0.001,NPHA2 vs.NPHA1;**P＜0.001,NPHA2 vs.NPHA2-EphB4-sh

NPHA1 0.16±0.015 NPHA2 5.45±0.46* NPHA2-EphB4-sh 0.93±0.13** Group（n=3）IC50（mg/L）

2.2 高三尖杉酯堿能夠促使復(fù)發(fā)耐藥的NPHA2細(xì)胞增強(qiáng)對(duì)伊馬替尼敏感性

流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)示，在IM（1.2 mg/L）的孵育下，復(fù)發(fā)耐藥的NPHA2細(xì)胞株凋亡率僅為2.35%±0.11%，顯著低于初治的NPHA1細(xì)胞株（71.82%±1.94%，P＜0.01）。但是當(dāng)HHT（濃度20 μg/L）和IM共孵育情況下，NPHA2細(xì)胞凋亡率增加到58.71%±2.39%，顯著高于IM單藥孵育下的NPHA2細(xì)胞凋亡率（P＜0.01，表2）。MTT測(cè)定法顯示，NPHA2細(xì)胞對(duì)于IM的IC50值為5.45 mg/L；但在HHT共孵育下，NPHA2細(xì)胞對(duì)于IM的IC50值從5.45下降至1.17 mg/L（P＜0.01）。

表2 高三尖杉酯堿和伊馬替尼對(duì)NPHA2細(xì)胞株凋亡的影響（±s）Table 2 Effect of HHT(20 μg/L)on the apoptosis of NPhA2 cell lines (±s)

表2 高三尖杉酯堿和伊馬替尼對(duì)NPHA2細(xì)胞株凋亡的影響（±s）Table 2 Effect of HHT(20 μg/L)on the apoptosis of NPhA2 cell lines (±s)

1P＜0.001，NPhA2 cells-imatinib（1.2 mg/L）vs.NPhA1 cells-imatinib（1.2 mg/L）；2P=0.121，NPhA2 cells-imatinib（1.2 mg/L）vs.NPhA2 cells-blank control；3P=0.002，NPhA2-IM（1.2 mg/L）vs.NPhA2-imatinib（1.2 mg/L）+HHT（20 μg/L）

Group（n=3）NPhA1 cells-imatinib（1.2 mg/L）NPhA2 cells-blank control NPhA2 cells-imatinib（1.2 mg/L）NPhA2 cells-IM（1.2mg/L）+HHT（20 ug/L）P Apoptosis rate（%）71.82±1.94 2.79±0.18 2.35±0.111，2，358.71±2.39＜0.001

2.3 EphB4調(diào)控下的白血病細(xì)胞株中RhoA蛋白活性變化

在NPHA1、NPHA2和NPHA2-EphB4-sh細(xì)胞中，蛋白活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)Rac1/cdc42磷酸化水平在NPHA2細(xì)胞中異常增高，但在NPHA2-EphB4-sh和NPHA1細(xì)胞中活性顯著下降（P＜0.01，圖2）。HHT孵育后，在NPHA2細(xì)胞株中，EphB4和Rac1/cdc42磷酸化水平顯著下降（P＜0.01，圖3）。

圖2 不同細(xì)胞株中EphB4/Rac1/cdc42磷酸化的變化Figure 2 Phosphorylation of EphB4/Rac1/cdc42 in cell lines

圖3 高三尖杉酯堿作用下不同細(xì)胞株中蛋白表達(dá)水平變化Figure 3 Expression of pathway protein after HHT incubation in cell lines

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EphB4在IM耐藥的NPHA2細(xì)胞中處于過(guò)表達(dá)狀態(tài)。在NPHA2-EphB4-sh細(xì)胞中，EphB4低表達(dá)的同時(shí)，對(duì)IM的敏感性也部分恢復(fù)，這表明EphB4能夠促進(jìn)CML對(duì)IM產(chǎn)生耐藥性。RhoA蛋白主要作用是調(diào)控細(xì)胞骨架、影響細(xì)胞遷移和生物學(xué)效應(yīng)［11］。RhoA信號(hào)蛋白通過(guò)非激酶依賴途經(jīng)參與IM耐藥機(jī)制［12］。通過(guò)測(cè)定RhoA激酶的重要信號(hào)蛋白R(shí)ac1/cdc42磷酸化水平，結(jié)果顯示Rac1/cdc42磷酸化在NPHA2-EphB4-sh細(xì)胞中明顯低于NPHA2細(xì)胞。隨著EphB4表達(dá)水平的變化，Rac1/cdc42磷酸化也出現(xiàn)相應(yīng)改變，EphB4通過(guò)調(diào)控RhoA來(lái)產(chǎn)生非激酶依賴途徑的耐藥機(jī)制。

臨床上HHT聯(lián)合IM能夠改善CML預(yù)后［13］，對(duì)于進(jìn)展期單純IM治療效果不佳的CML患者，HHT聯(lián)合IM能夠提高部分患者的血液學(xué)反應(yīng)、改善其預(yù)后［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，HHT聯(lián)合IM可以提高耐藥的NPHA2細(xì)胞凋亡率和增殖抑制率。在HHT的干預(yù)作用下，NPHA2細(xì)胞中的EphB4/RhoA通路表達(dá)水平出現(xiàn)了顯著下降。

總之，對(duì)于EphB4及其受體在白血病演進(jìn)中的復(fù)雜角色仍有待探索。本研究結(jié)果顯示EphB4過(guò)表達(dá)能夠激活RhoA非激酶依賴的耐藥途徑。從作用機(jī)制上，本研究結(jié)果示HHT聯(lián)合IM治療CML的有效性原因在于，HHT通過(guò)阻斷EphB4/RhoA通路來(lái)增強(qiáng)CML患者細(xì)胞株對(duì)于IM的敏感性。

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5 Huang BT,Zeng QC,Zhao WH,et al.Homoharringtonine contributes to imatinib sensitivity by blocking the EphB4/RhoA pathway in chronic myeloid leukemia cell lines[J].Med Oncol,2014,31 (2)：836.

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10 Li R,Liu XL,Du QF,et al.Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis analysis of apoptosis in K562 cells induced by harringtonine[J].Ai Zheng,2004,23(10)：1155-1160.

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13 O'Brien S,Talpaz M,Cortes J,et al.Simultaneous homoharringtonine and interferon-alpha in the treatment of patients with chronic phase chronic myelogenous leukemia[J].Cancer,2002,94(7)：2024-2032.

（2014-05-06收稿）

（2014-06-30修回）

（本文編輯：鄭莉）

黃彬濤 博士，副主任醫(yī)師。專業(yè)方向?yàn)槟[瘤病理學(xué)。

E-mail：huangbintao1979@sina.com

·讀者·作者·編者·

“腫瘤代謝與營(yíng)養(yǎng)”有獎(jiǎng)?wù)魑?/p>

為促進(jìn)我國(guó)腫瘤代謝、營(yíng)養(yǎng)與支持治療的基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用、規(guī)范腫瘤患者的營(yíng)養(yǎng)治療、提高對(duì)營(yíng)養(yǎng)治療在腫瘤多學(xué)科綜合治療中重要性的認(rèn)識(shí)，《腫瘤代謝與營(yíng)養(yǎng)電子雜志》與中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)腫瘤營(yíng)養(yǎng)與支持治療專業(yè)委員會(huì)聯(lián)合舉辦“腫瘤代謝與營(yíng)養(yǎng)”有獎(jiǎng)?wù)魑幕顒?dòng)。具體事宜如下：

一、征文要求

1.征文對(duì)象：全球臨床工作者、基礎(chǔ)研究人員及其他有興趣的人員。

2.征文語(yǔ)言：中文。

3.征文內(nèi)容：有關(guān)腫瘤代謝、營(yíng)養(yǎng)與支持治療的原創(chuàng)性研究或Meta分析。

4.文章要求：全文4000字左右（含參考文獻(xiàn)），需附中、英文摘要，摘要500字（詞）左右，采用第三人稱撰寫。摘要必須包括目的、方法、結(jié)果（列出主要數(shù)據(jù)）、結(jié)論4個(gè)部分。所有圖片應(yīng)為彩圖，除外CT、MRI及X片。圖表要求有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)。

5.投稿方式：提供完整電子版本，通過(guò)Email發(fā)送至cancernutrition@163.com。

6.截稿時(shí)間：2015年3月31日。

二、獎(jiǎng)項(xiàng)設(shè)置

此次征文活動(dòng)設(shè)一、二、三等獎(jiǎng)，向獲獎(jiǎng)作者頒發(fā)證書并給予獎(jiǎng)勵(lì)，獲獎(jiǎng)?wù)撐膬?yōu)先在《腫瘤代謝與營(yíng)養(yǎng)電子雜志》發(fā)表。對(duì)獲獎(jiǎng)前10名作者，全額資助參加2015年5月15-17日第三屆《全國(guó)腫瘤營(yíng)養(yǎng)與支持治療學(xué)術(shù)會(huì)議》及第三屆全國(guó)腫瘤營(yíng)養(yǎng)優(yōu)秀論文評(píng)比。

三、活動(dòng)組織

1.論文評(píng)比實(shí)行匿名制，從（1）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（合理，不存在明顯缺陷）；（2）方法（可靠，統(tǒng)計(jì)方法正確）；（3）研究結(jié)果（可信，解決問(wèn)題，有理論或?qū)嵺`意義）；（4）討論（切題，實(shí)事求是）；（5）學(xué)術(shù)道德（無(wú)剽竊、故意造假等）；（6）英文摘要翻譯6方面進(jìn)行評(píng)比。

2.2015年4月30日前公布獲獎(jiǎng)結(jié)果，獲獎(jiǎng)名單將公布于《腫瘤代謝與營(yíng)養(yǎng)電子雜志》、中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)腫瘤營(yíng)養(yǎng)與支持治療專業(yè)委員會(huì)網(wǎng)站與中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)網(wǎng)站，并抄送獲獎(jiǎng)作者單位。

3.其他未盡事宜請(qǐng)與石英英老師聯(lián)系，電話13650878799，郵箱syy1213@126.com。

《腫瘤代謝與營(yíng)養(yǎng)電子雜志》

中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)腫瘤營(yíng)養(yǎng)與支持治療專業(yè)委員會(huì)

2014年8月30日

Homoharringtonine contributes to imatinib sensitivity in chronic myeloid leukemia cell lines

Bintao HUANG1,Weihong ZHAO2,Zhen XIAO1,Da GAO1

Bintao HUANG;E-mail:huangbintao1979@sina.com
1Department of Hematology,the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010059;2Department of Gastroenterology,theAffiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010059,China
This work was supported The Natural Science Foundation of Inner Mongolia(No.2013MS1157)and Inner Mongolia Autonomous Region Health and Family Planning Health Research Projects(No.201302059)

Objective:To investigate the mechanism responsible for homoharringtonine(HHT),which contributes to imatinib (IM)sensitivity in the chronic myeloid leukemia(CML)cell line.Methods:We established cell lines from a patient with CML at the time of first diagnosis and relapse phase,and designated the cell lines as NPHA1 and NPHA2,respectively.Stable underexpressed EphB4 cells(NPHA2-EphB4-sh)were obtained.Leukemia cell lines were incubated with HHT.The activated signal proteins in cells were tested by Western blot.Results:EphB4 was overexpressed in IM-resistant NPHA2 compared with the NPHA1 cell line.However, the expression of EphB4 mRNA and protein were significantly decreased in knockdown NPHA2-EphB4-sh cells compared with the NPHA2 and NPHA1(P＜0.001)cell lines.NPHA2-EphB4-sh cells were sensitive to IM(IC50:0.93 mg/L),and NPHA2 showed IM resistance(IC50:5.45 mg/L)(P＜0.001).However,co-stimulation with HHT+IM decreased IC50 of NPHA2 cells to 1.17 mg/L(P＜0.001).Meanwhile,phospho-Rac1/cdc42 was significantly increased in NPHA2 cells compared with NPHA2-EphB4-sh(P＜0.001). HHT blocked the expression of EphB4/RhoA.Conclusion:The overexpression of EphB4 contributed to IM resistance in CML line cells.EphB4/RhoA may be a new marker of IM resistance.HHT with IM yielded more treatment advantages than IM alone by blocking EphB4/RhoApathways.

homoharringtonine,imatinib,chronic myeloid leukemia

10.3969/j.issn.1000-8179.20140758

①內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液科（呼和浩特市010059）；②消化科

?本文課題受內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：2013MS1157）、內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)醫(yī)療衛(wèi)生科研計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：201302059）資助

黃彬濤 huangbintao1979@sina.com